miR-335 调控Survivin和NF-κB表达对B细胞淋巴瘤细胞侵袭、迁移和凋亡的影响①

邢丽娜 田 甜 王 颖 郭晓楠 （河北医科大学第二医院血液内科，石家庄 050051）

B 细胞淋巴瘤是来源于成熟B 细胞的恶性增生性疾病，其发病率居恶性肿瘤第五位［1］。临床上对B 细胞淋巴瘤的诊断治疗主要以化疗和放疗为主，但其具有易发生转移和复发的特点，导致病死率居高不下［2］。Survivin 蛋白是凋亡抑制蛋白，是目前发现最强的凋亡抑制基因。研究表明，淋巴瘤的转移和复发与Survivin 蛋白的表达密切相关，Survivin 蛋白主要通过抑制Caspase-3 和Caspase-7 活性从而抑制细胞凋亡，在肿瘤细胞的转移中发挥重要作用［3-4］。NF-κB 是一种参与肿瘤细胞增殖和凋亡的重要核转录因子，其活性被抑制会引起肿瘤细胞凋亡。miRNA 通过调控肿瘤相关基因，与其靶基因mRNA特定位点碱基互补配对，形成转录复合物，抑制相关蛋白表达，发挥抑癌作用。研究发现：miR-335 在多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程中发挥作用，如前列腺癌细胞、膀胱癌细胞和肝癌细胞［5-7］。目前国内外尚无针对miR-335在B 细胞淋巴瘤细胞中表达情况及作用机制的相关研究报道。本研究通过探讨miR-335 在B 细胞淋巴瘤细胞中过表达对B 细胞淋巴瘤细胞Survivin 蛋白的表达水平及侵袭、迁移和凋亡能力的影响，分析其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 B 细胞淋巴瘤细胞株SU-DHL-4 购自中国科学院上海细胞库，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基传代培养；RPMI1640 培养基、胎牛血清购自杭州四季青公司；RNA 提取试剂、TRIzol 试剂购自 Invit‑rogen公司；所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；逆转录试剂盒、PCR 扩增试剂盒购自美国Invitrogen 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂、鼠抗人Survivin 单克隆抗体和HRP 标记的山羊抗兔IgG 购自美国Abeam 公司；鼠抗人 NF-κB p65单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司；Transwell 检测小室购自上海生博生物医药科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染与分组 取对数生长期SU-DHL-4细胞，以0.25%胰酶消化，接种于96孔板，待细胞生长至80%融合时，置于无血清培养基12 h 后转染。转染分为对照组（不做任何处理）、空转染组（转染空载体）、过表达组（转染miR-335），转染均严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.2 RT-PCR 检测miR-335 表达水平 采用RTPCR 检测miR-335 表达水平，取上述3 组细胞转染48 h，采用TRIzol法提取总RNA，逆转录试剂盒反转录为cDNA。参照GenBank 中的基因序列，利用Primer premier 6.0 软件设计目的基因miR-335 的RT-PCR 引物，以 cDNA 为模板，应用 PCR 扩增仪进行扩增，操作严格按照PCR 试剂盒说明书进行。miR-335 正向引物：5'-CGTCCTCGTCAAGAGCAATAAC-3'；反向引物：5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCT‑GTGTC-3'；内参 β-actin 正向引物：5'-CACGATG‑GAGGGGCCGGACTCATC-3'；反向引物：5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。 反 应 条 件 ：25 ℃30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用 2−ΔΔCt法计算miR-335的相对表达量。

1.2.3 Western blot 检测 Survivin 和 NF-κB 蛋白表达 取上述3 组细胞转染48 h，加入适量细胞裂解液提取总蛋白，BCA 试剂盒检测提取蛋白的浓度，采用10%SDS-PAGE 分离，半干法PVDF 转染，5%脱脂奶粉封闭，加入Survivin 一抗（1∶500）、NF-κB 一抗（1∶1 000）和β-actin 抗体（1∶1 000），4 ℃过夜，洗膜后加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（1∶5 000），室温孵育1 h，洗膜后采用增强化学发光法（ECL）显色，以β-actin 为内参，目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值反映各蛋白表达，公式如下：蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.2.4 划痕实验检测各组细胞的迁移能力 取上述3组细胞转染48 h，悬液以3×104个/孔分别接种至96 孔板（100 µl），每组设 5 个复孔，37 ℃培养24 h，至细胞达到90%以上融合度，使用划痕仪对准96 孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。使用RPMI1640 培养基轻轻漂洗，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，0 h、24 h 时在荧光显微镜下观察拍照，计算各组细胞迁移率。

1.2.5 Transwell 检测细胞侵袭能力 Transwell 小室内膜加入Matrigel 胶并置于24 孔板，待胶凝固后实验。取3 组转染48 h 的细胞，并调整细胞浓度为1×105个/ml，以 200 µl/孔将细胞悬液加入 Transwell小室，加入含10%小牛血清的RPMI1640 培养基800 µl，37 ℃培养24 h，取出小室，用棉签擦拭内膜上的细胞，预冷甲醇固定30 min，弃甲醇，1%结晶紫染色20 min，倒置显微镜下随机观察5 个视野，并计穿膜细胞数，实验重复6次取平均值。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 取上述3 组细胞转染48 h，加入预冷PBS洗涤细胞，采用胰蛋白酶消化细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，离心收集细胞，经Annexin V-FITC/PI 染色后，置于流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验步骤严格按照细胞凋亡试剂盒的操作。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0 统计学软件，所有数据符合正态分布，以表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用独立t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组B 细胞淋巴瘤细胞miR-335 表达水平比较 与对照组相比，空转染组miR-335 表达水平差异无统计学意义（P>0.05），过表达组miR-335 表达水平明显升高（P<0.05）；与空转染组相比，过表达组miR-335表达水平明显升高（P<0.05），见图1。

图1 各组B细胞淋巴瘤细胞miR-335表达水平比较Fig.1 Comparison of expression level of miR-335 in B cell lymphoma cells in each group

2.2 miR-335 过表达对 Survivin 和 NF-κB 蛋白表达的影响 与对照组相比，空转染组Survivin和NF-κB蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），过表达组 Survivin 和 NF-κB 蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与空转染组相比，过表达组Survivin和NF-κB蛋白表达水平明显降低（P<0.05），见图2。

图2 各组B 细胞淋巴瘤细胞Survivin 和NF-κB 蛋白表达水平比较Fig.2 Comparison of expression levels of Survivin and NF-κB protein in B cell lymphoma cells in each group

2.3 miR-335 过表达对细胞迁移和侵袭能力的影响 与对照组相比，空转染组细胞迁移率、侵袭细胞数差异无统计学意义（P>0.05），过表达组细胞迁移率和侵袭细胞数明显降低（P<0.05）；与空转染组相比，过表达组细胞迁移率和侵袭细胞数明显降低（P<0.05），见图3、4。

图3 各组B细胞淋巴瘤细胞迁移率比较Fig.3 Comparison of cell mobility of B cell lymphoma cells in each group

图4 各组B细胞淋巴瘤侵袭细胞数比较Fig.4 Comparison of invasion numbers of B cell lymphoma cells in each group

2.4 miR-335 过表达对细胞凋亡的影响 与对照组相比，空转染组细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05），过表达组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与空转染组相比，过表达组细胞凋亡率明显升高（P<0.05），见图5。

图5 各组B细胞淋巴瘤细胞凋亡率比较Fig.5 Comparison of apoptosis rate of B cell lymphoma cells in each group

3 讨论

B 细胞淋巴瘤是目前常见的成人淋巴瘤，大多数患者在接受治疗后效果较好，但仍有1/3 患者出现治疗无效和复发的情况。近年来，生物靶向治疗成为肿瘤治疗的新思路，尤其是利用基因靶向治疗［8］。miRNA 作为重要的生物体基因调控分子，其在肿瘤治疗中的应用已成为生物领域研究的热点。miRNA是一种由19~25个核苷酸组成的非编码单链RNA，于细胞核中生成，具有高度保守性，成熟的miRNA 结合到与其互补的靶基因mRNA 位点继而调控其靶基因表达，参与细胞的增殖、凋亡等生命过程［9］。如 miR-193b-5p 可通过靶向 CD44v6 在乳腺癌中发挥抑癌功能［10］；miR-145 通过靶向 HCT116 抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭、凋亡［11］。研究表明，miRNA 可通过抑制其靶基因Survivin 影响癌细胞的多种生物学行为，是膀胱癌潜在的治疗靶点［12-13］。

Survivin 基因是1997 年发现的抑制基因，基因构成包含3个内含子和4个外显子，是目前发现最强的凋亡抑制基因。Survivin 基因的表达产物Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族的最小成员，在绝大多数正常组织中不表达。研究表明，在恶性肿瘤组织中，Survivin 蛋白呈高表达水平，如直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌等［14-16］。Survivin 参与了肿瘤细胞的恶变和抗凋亡的生理过程，具有抑制细胞凋亡和调控有丝分裂两个主要生理学功能，当Survivin 位于线粒体内时，机体表现为抑制细胞迁移，当其位于胞浆内时，表现为调节间期微管的稳定性，进而参与调节细胞周期［17-18］。Survivin 在恶性肿瘤组织中处于失衡状态，是抗肿瘤治疗的一个重要突破点［19-20］。NF-κB 是调控细胞凋亡的细胞因子，抑制 NF-κB 表达可促进肿瘤细胞凋亡。此外，NF-κB 参与Survivin转录过程：Survivin 可上调IKKp 启动子的转录活性，提高IKKp在体内的表达水平，促进NF-κB活化，两者有着密切联系［21］。本研究显示：B 细胞淋巴瘤细胞过表达 miR-335 后，Survivin 和 NF-κB 蛋白表达水平降低，细胞凋亡率增加，说明过表达miR-335可通过下调Survivin 蛋白表达，抑制NF-κB 蛋白表达诱导细胞凋亡。此外，细胞迁移率和侵袭细胞数明显降低，提示miR-335 对抑制B 细胞淋巴瘤细胞迁移和侵袭具有一定作用。

综上所述，上调B 细胞淋巴瘤细胞miR-335 表达可通过下调Survivin 表达，抑制NF-κB 蛋白表达，诱导细胞凋亡，并抑制细胞迁移和侵袭能力，能够为B细胞淋巴瘤的生物靶向治疗提供理论依据。