长链非编码RNA-B230352I09 表达改变对H9C2 心肌细胞增殖及周期的影响

徐斐翔，汪 升，薛明明，童朝阳，陈玉梅

复旦大学附属中山医院急诊科，上海 200032

心力衰竭是心血管疾病的终末阶段，其患病率的不断上升，对医疗保健系统和经济发展产生巨大影响［1］。研究［2］表明，心肌细胞数量减少是心肌梗死等心肌损伤因素导致心力衰竭的主要原因。因此，提高心肌细胞增殖能力成了心脏疾病治疗的关键。

近年来大量研究发现长链非编码RNA （long noncoding RNA，lncRNA）参与调控心肌细胞增殖，在心脏再生医学中具有重要意义［3］。如lncRNA NR_045363 通过与微RNA（microRNA，miR）-216a的相互作用刺激心肌细胞增殖并改善心肌功能［4］。lncRNA of Dachshund Homolog 1（lncDACH1）在出生后的小鼠心脏中表达升高，心脏特异性过表达lncDACH1可抑制心脏再生，敲除lncDACH1可以重新激活心肌细胞增殖潜力；lncDACH1通过直接与蛋白磷酸酶1 催化亚基α 结合，增加心肌细胞增殖，促进心肌再生［5］。然而，现有lncRNA 数据资源有限，仍需大量研究探索其参与心肌细胞增殖的生物学功能和分子机制。

lncRNA-B230352I09 是一条功能未知的lncRNA，在新生1 d 的小鼠心脏组织高表达，但在7 d 的小鼠心脏组织中几乎不表达［6］。相关研究［7］表明，出生1 d 的小鼠在心尖切除手术后心肌细胞仍具有增殖能力，损伤心肌能完全恢复；而出生7 d的小鼠接受同样手术后，心肌细胞却丧失了增殖的能力。因此，我们推测lncRNA-B230352I09 可能参与心脏再生过程。本研究拟通过H9C2 心肌细胞探索lncRNA-B230352I09 对心肌细胞增殖及周期的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 H9C2 细胞 鼠胚胎心肌细胞H9C2 购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.1.2 试剂与仪器 无菌超净台、细胞培养箱、生物安全柜（Thermofisher公司，美国），DMEM 培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco 公司，美国）；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、探针、定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（Life Technology公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK8）、阳离子脂质体Lipofectamine 3000 （Lipo3000）、5-乙 炔 基-2'-脱 氧 尿 嘧 啶（5-ethynyl-2'-deoxyuridine， EdU） 免 疫 荧 光 试 剂 盒（Invitrogen公司）；细胞周期检测试剂盒（凯基生物公司，中国）；实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）仪（ABI公司，美国）；流式细胞仪（Becton Dickinson公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 H9C2 心肌细胞培养 将大鼠的H9C2 心肌细胞接种于培养皿中，常规培养于含有10%FBS 和1%青霉素/链霉素的DMEM 完全培养基中。培养条件：37 ℃、5%CO2和95%饱和湿度。间隔1 d 更换新鲜培养基，待细胞贴壁生长融合度达到80%后，进行传代培养，用于后续试验。

1.2.2 细胞转染 lncRNA-B230352I09 过表达质粒（pcDNA-B230352I09）和阴性对照（negative control，NC）载体（pcDNA-NC）由上海吉玛生物公司合成。取对数生长期的细胞接种于6 孔细胞培养板，待细胞融合度达50%～60%时更换无血清培养液，加入转染质粒和Lipo3000 转染液，培养6 h 后更换新鲜培养基继续培养。实验分为空白对照组（无任何处理）、阴性对照组（转染pcDNA-NC）、lncRNA-B230352I09过表达组（转染pcDNA-B230352I09）。

1.2.3 细胞增殖检测 CCK8 法：将处于对数生长期，细胞状态良好的细胞按照3 000 个/孔的密度接种于96孔板中，随后分别于转染24 h、48 h和72 h加入CCK8 溶液，孵育2 h 后置于酶标仪，测量450 nm 波长的吸光度（optical density，OD）值，绘制生长曲线。每个样品重复测量3 次。EdU 检测：化学试剂EdU 可以特异地结合到新合成的DNA 中并被荧光显微镜检测，用来评估细胞增殖情况。将培养的H9C2细胞进行EdU 标记、固定、洗涤和通透，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）细胞核染色后，置于荧光显微镜下观察。

1.2.4 细胞周期检测 转染后72 h 用胰蛋白酶消化并收集细胞，70%乙醇、20 ℃固定过夜，固定好的细胞使用碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色液染色，于流式细胞仪检测细胞周期中G1期、S期、G2期细胞比例变化。每个样品重复测量3次。

1.2.5 RT-PCR 检测 用RNA 提取试剂盒提取总RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA 模板，GAPDH为内参，分别设计扩增基因的引物，其中lncRNA-B230352I09 的正向引物序列为5'ATCACAA CAATCCCTTCCAC3'，反向引物序列为5'GCAACA GAAAAGAAACCAAGA3'。细胞周期蛋白（cyclin D1）正向引物序列为5'GCCCTCCGTTTCTTACTTCA 3'，反向引物序列为5'CTCCTCTTCGCACTTCTGCT 3'。细胞周期蛋白依赖性激酶1 （cyclin dependent protein kinase 1，CDK1） 正 向 引 物 序 列 为5'TCTTCGCTCGTTAAGAG TTAC3'，反向引物序列为5'ATCTGCCAGTTTGATT GTTC3'。GAPDH正 向引物序列为5′GACCTGACCT GCCGTCTA3′，反向引物序列为5′AGGAGTGGGT GTCGCTGT3′。PCR仪上进行扩增，反应条件：95 ℃，10 min 预变性，95 ℃15 s，60 ℃1 min，重复40 个循环。结果用2-ΔΔCT方法进行分析。实验独立重复3次。

1.2.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分析处理，数据以±s表示，多组间比较行单因素方差分析，组间两两比较行F检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR 检 测lncRNA-B230352I09 过 表 达效率

空白对照组、阴性对照组及lncRNA-B230352I09过表达组3 组间lncRNA-B230352I09 表达水平，差异具有统计学意义（P=0.000），其中空白对照组和pcDNA-NC 组相比，lncRNA-B230352I09 的表达，差异无统计学意义；与pcDNA-NC 组相比，lncRNAB230352I09过表达组中lncRNA-B230352I09表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P=0.000），提示转染构建成功（图1）。

图1 lncRNA-B230352I09过表达效率的检测Fig1 Detection and validation of lncRNA-B230352I09 overexpression efficiency

2.2 lncRNA-B230352I09 过 表 达 对H9C2 细 胞 增殖的影响

CCK8检测显示：在不同时间点（24 h、48 h、72 h）3组细胞增殖能力差异均具有统计学意义（P=0.000）；与pcDNA-NC组比较，pcDNA-B230352I09过表达组表现为明显的时间依赖性细胞增殖能力增强（图2A），差异均具有统计学意义（24 h：P=0.000；48 h：P=0.000；72 h：P=0.001）。荧光显微镜下观察EdU标记阳性细胞，结果显示pcDNA-B230352I09过表达组EdU阳性细胞比例明显高于对照组（图2B）。

图2 lncRNA-B230352I09过表达对心肌细胞增殖的影响Fig 2 Effect of lncRNA-B230352I09 overexpression on proliferation of cardiomyocytes

2.3 lncRNA-B230352I09 过 表 达 对H9C2 细 胞 周期的影响

转染72 h 后检测细胞周期，如图3A 所示，3 组在G1期和S 期细胞比例差异具有统计学意义（P＝0.000），在G2期细胞比例的差异无统计学意义；其 中pcDNA-NC 组G1期 细 胞 比 例 为（57.99±0.09）%，S 期为（25.78±0.1）%，G2期为（16.23±0.06）%；pcDNA-B230352I09 过表达组G1期细胞比例为（52.19±1.3）%，S 期为（31.72±1.2）%，G2期为（16.09±0.15）%。和pcDNA-NC 组相比，pcDNAB230352I09过表达组G1期细胞比例减少，S期细胞比例明显增加，差异具有统计学意义（均P＝0.000）。进一步利用RT-PCR 检测心肌细胞cyclin D1 和CDK1的mRNA表达情况发现：3组间基因mRNA 表达差异具有统计学意义（均P＝0.000）；与pcDNA-NC 组比较， pcDNA-B230352I09 组cyclin D1 和CDK1的mRNA 表达水平显著升高（图3B），差异具有统计学意义（均P＝0.000）。

图3 lncRNA-B230352I09过表达对心肌细胞细胞周期的影响Fig 3 Effect of lncRNA-B230352I09 overexpression on cell cycle of cardiomyocytes

3 讨论

预防心力衰竭的理想手段需要补偿丢失的心肌细胞，然而，一些研究［8］已经确定心脏中没有心脏干细胞，且新增心肌细胞来源于现有的心肌细胞。因此，寻找成熟心肌细胞的增殖调控因素成为研究学者的焦点。已有大量研究［9］表明可以通过调节细胞周期转录因子、非编码RNA、细胞外基质和细胞结构、多种信号通路如Hippo 和NRG-1/ErbB 通路等促进心肌细胞增殖，提示诱导成熟心肌细胞增殖能力的激活是促进内源性心脏修复和预防心力衰竭的可行方法。本研究从细胞增殖的角度探讨lncRNA-B230352I09在心肌细胞中的作用。实验采用CCK8 法间接测定心肌细胞增殖数量，EdU 检测心肌细胞的DNA 合成情况。结果表明lncRNA-B230352I09 过表达的心肌细胞数量、DNA合成均明显增加，提示lncRNA-B230352I09能够促进心肌细胞增殖和分裂。

目前普遍认为心肌细胞终末分化时变成双核细胞而“退出”细胞周期，不再增殖［10］，故成年心肌细胞增殖的关键过程是使其重新进入细胞周期。细胞周期的进行取决于细胞周期蛋白和CDK 的协调反应，调节DNA 合成和细胞分裂。在出生后心脏生长期间，心肌细胞周期活动开始减少，伴随细胞周期蛋白和CDK 的表达减少［11］。因此，靶向调节细胞周期促进心肌细胞增殖是心脏再生的有效方法。研究［12］显示，CDK1、CDK4、cyclin B1 和cyclin D1的过表达明显促进小鼠、大鼠和人心肌细胞的细胞分裂，减少心肌损伤后瘢痕的形成。其中cyclin D1是G1期细胞增殖信号的关键蛋白，可诱导细胞进入S 期［13］。在 本 研 究 中 发 现，lncRNA-B230352I09 过表达的H9C2 心肌细胞CDK1和cyclin D1 的mRNA 水平明显增加；且流式细胞仪检测显示lncRNAB230352I09 可促进心肌细胞进入S 期。因此，我们得出结论：lncRNA-B230352I09 能够通过调节cyclin D1 和CDK1，促进心肌细胞进入S 期，增强心肌细胞增殖能力。

本研究仍存在不足之处：①H9C2 心肌细胞［14］来源大鼠胚胎心脏组织，虽然作为心脏疾病常用研究对象，但不能真实反映原代心肌细胞的生物性状及人体成熟心肌细胞的状态，需要进一步验证。②本研究仅观察到lncRNA-B230352I09 对H9C2 心肌细胞常规培养状态下增殖表型的作用，对其损伤刺激状态下的表型变化有待进一步探索。

本实验研究结果表明，lncRNA B230352I09 有可能通过促进心肌细胞增殖成为维持心脏结构和改善心脏功能的潜在有效途径。 本研究为lncRNAB230352I09 在缺血缺氧损伤心肌细胞中的研究奠定了一定基础，为应用于慢性心力衰竭等心脏疾病的治疗提供了一定理论依据。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者贡献/Authors'Contributions

陈玉梅、童朝阳参与了实验设计；徐斐翔、汪升参与了实验的具体执行；徐斐翔、汪升、薛明明参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by CHEN Yumei and TONG Chaoyang. The experiments were performed by XU Feixiang and WANG Sheng. The manuscript was drafted and revised by XU Feixiang， WANG Sheng and XUE Mingming.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-02-14

·Accepted：2022-05-16

·Published online：2022-05-28