制冷喷雾联合高分子水凝胶对急性烧伤创面的影响

董叫云，宋 菲，陆树良，刘 琰，田 鸣

上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤科，上海 200025

烧伤是常见的创伤之一，世界卫生组织认为烧伤是一种重大的公共卫生危机，全球每年约有1 100 万人需要进行烧伤的救治，尽管在治疗方略上已做出巨大改进，但由烧伤导致的死亡率仍然很高［1-3］。即便幸存，患者仍可能面临毁容和终身残疾，对家庭及社会产生深远的负面影响［4］。据报道［5-9］，科学的早期处理方式可降低死亡率，提高预后质量。

烧伤发生后，即使热源不再存在，皮肤组织前期所吸收热量仍会继续释放至更深的组织层中，导致损伤程度不断加深。迅速降低创面温度可以显著减少组织进行性损伤，促进血管收缩，减少炎症因子的释放，既为创伤修复奠定基础，也可减轻患者的疼痛感，并降低瘢痕产生的概率［10］。因此，烧伤的及早快速救治对于减轻进行性损伤、提高预后有重大意义。用冷水快速冲洗急性烧伤创面，被认为是常用的家庭急救方法［11］。然而，在特定身体部位（如颈部、背部或臀部），烧伤后使用冷水冷却极不方便，且在就医运输过程中无法实现持续的冷水冲洗，加之烧伤会破坏正常的皮肤屏障，损害宿主抵抗感染的能力，使暴露的创面更易受到微生物的侵害［12］。因此有必要开发一种低成本、高效的急救产品（改良敷料），以解决上述问题。

理想的伤口敷料能够提供湿润的愈合环境，防止细菌感染，同时具有良好的生物相容性和成本效益［13］。随着生物材料的发展，各种敷料材料，如纳米纤维、泡沫、膜和水凝胶，已被用于创面管理。其中，水凝胶因其特殊的性质而引起了极大的关注［14］。水凝胶同时具有冷却、覆盖伤口、促进烧伤组织散热的功能，可以应用于身体的所有部位［15-17］。本研究设计了一种水溶性高分子凝胶（水溶性聚合物），具有较强的吸热性，可以降低皮肤表面的温度。同时设计了一种可及时喷出大量雾状液体的罐装冷却喷雾剂，可快速降温。拟通过在大鼠烫伤模型中单独和联合应用制冷喷雾剂和水凝胶，观察这些急救产品对伤口深度和炎症反应的干预效果，来验证其在烧伤早期救治中的作用，旨在探索一种便携式、有效的急救用品，以降低烧伤程度，改良预后，减少患者的痛苦。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择体质量200～220 g 的Sprague-Dawley 大鼠（购自上海斯莱克实验动物有限公司）。饲养于室温（22±2）℃下，光/暗周期为12 h，可以随意获得食物和水。实验前，动物禁食16 h。所有程序均按照动物福利的国际标准和道德标准进行。

1.2 制冷喷雾剂的制备及冷却实验

将生理盐水与75%乙醇以不同体积比（φ=10%、15%和20%）进行混合。将混合物置于高压喷雾罐中，并冲入氮气。氮气∶液体比为3∶7，气罐压力为1.8 MPa。在室温下将温度计加热至80 ℃。当温度计温度降至70 ℃时，用喷雾装置将普通自来水（用作对照处理）和不同浓度的制冷喷雾剂分别喷洒到温度计上，记录温度计温度从70 ℃降至20 ℃所需的时间，并比较差异。

1.3 水凝胶制备和冷却试验

聚合物水凝胶由聚丙烯酸钠（5%）、甘油（25%）、氨基乙酸二羟基铝（0.15%）、EDTA-2Na（0.1%）、酒石酸（0.25%）、乙醇（0.5%）和纯化水（69%）制备而成（上述试剂来自上海国药集团化学试剂有限公司）。将前4种试剂配制成油相，后3种试剂配制成水相后，在真空状态下将这2 种试剂混合并搅拌，将混合物摊铺在防水无纺布上，并压平。观察聚合物水凝胶的冷却效果：准备2 个300 mL 烧杯，其中1 个烧杯涂有水凝胶。然后，向每个烧杯中加入240 mL 70 ℃的纯水，并安装温度计测量温度。连续记录9 h的温度。

1.4 皮肤刺激强度试验

成年、健康、无皮损的SD 大鼠12 只，在SPF 级实验动物室中适应至少1 周。实验前约24 h 剪去背部脊柱两侧的毛发而不损伤表皮。脱毛范围为每侧5 cm×5 cm。将动物分为2 组：制冷喷雾剂组和水凝胶组。制冷喷雾剂组大鼠背部皮肤一侧喷洒制冷喷雾剂，水凝胶组大鼠背部皮肤一侧附着水凝胶。2 组大鼠中皮肤的另一侧不进行任何处理，作为对照。2 h后完成实验，用温水擦洗皮肤。于1、24、48 和72 h后评估皮肤刺激反应，如红斑和水肿。根据表1 中的参数进行评分，计算刺激分数。根据表2 中的参数评分，计算每个观察点的平均皮肤刺激强度。

表1 皮肤刺激试验的分级值Tab 1 Grading values for the skin irritation test

表2 皮肤刺激强度分级值Tab 2 Grading values for the skin irritation intensity

1.5 烫伤创面动物模型

另外12 只成年健康SD 大鼠（无皮肤损伤）在SPF实验动物室适应性饲养至少1周。腹腔注射2.5%戊巴比妥钠（中国上海宇燕仪器有限公司）进行麻醉，剂量为35 mg/kg。剪除背部长毛，残存鼠毛用温水湿润后，涂脱毛剂（2 mm 厚）。2 min 后，用温水清洗脱毛剂，干纱布吸去多余水分。这些老鼠分笼饲养于无菌笼内，自由进食和饮水。24 h后，用上述相同方法麻醉大鼠。将2 块质量相同的圆形铜冲头（直径2 cm）在沸水中加热5 min，直接放在大鼠左右脱毛区域3 s，不施加任何压力，造成烫伤［18］。

1.6 烫伤创面干预

将烫伤后的大鼠随机分为2 组，每组6 只，采用背部皮肤组织互相对比的方法，将动物分成A 组和B组（每组n=6）。在A 组中，烫伤皮肤的一侧用制冷喷雾剂处理3 min，然后附着水凝胶，而另一侧不进行任何处理。B 组大鼠，烫伤皮肤的一侧用制冷喷雾剂3 min，然后附着水凝胶，另一侧用普通自来水喷洒3 min（见图1）。24 h 后，对比左右两侧不同处理方式的创面形态，观察创面深度和炎症程度。使用Adobe Photoshop CC 2019和Image Pro Plus 6.0分析伤口和焦痂面积，计算并比较不同治疗方法的焦痂占伤口面积的百分比。

图1 伤后各组大鼠创面干预示意Fig 1 Schematic diagram of wound treatment of rats in each group after injury

1.7 组织学观察

烫伤24 h 后，用200 mg/kg 戊巴比妥钠注射液处死大鼠。取创面边缘的皮肤组织在10 %福尔马林溶液中固定至少24 h。石蜡包埋后，切成4 μm 厚的切片。将石蜡切片固定在载玻片上并用苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H-E staining，H-E 染色）。使用全景扫描仪（Pannoramic DESK，匈牙利）扫描和观察切片，并观察皮肤组织中炎性细胞的浸润情况。

1.8 统计学方法

定量数据采用±s表示。组间差异通过单因素方差分析确定，使用GraphPad Prism 5.0进行Bonferroni事后检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 制冷喷雾剂的冷却效果

成功制备了高压制冷喷雾剂（图2）。评估了制冷喷雾剂的冷却效果。结果表明，不同浓度的制冷喷雾剂的冷却速度与普通自来水相比，差异具有统计学意义（P=0.032，P=0.002，P=0.003）。此外，15%制冷喷雾剂的冷却速度显著高于10%制冷喷雾剂，差异具有统计学意义（P=0.037），15%和20%制冷喷雾剂的冷却速度的差异无统计学意义（P=0.891）。因此，随后的实验选择了15%的制冷喷雾剂（表3）。

图2 高压制冷喷雾剂Fig 2 The high-pressure cryogen spray tank

表3 不同浓度制冷喷雾剂和普通自来水干预后的冷却速度Tab 3 The cooling rate of cryogen spray with different concentrations and ordinary tap water

2.2 水凝胶制备和冷却效果

制备的水凝胶呈蓝色，附着在无纺布上（图3）。水凝胶的冷却效果可以维持8 h，温度可以在2 h内降至室温［（22±2）℃］（图4）。水凝胶组的温度低于对照组，平均差异为5.15 h。

图3 附着于无纺布的水凝胶Fig 3 The hydrogel attached to a non-woven fabric

图4 水凝胶的冷却效果Fig 4 Cooling effect of hydrogel

2.3 皮肤刺激性实验

在干预1、24、48 和72 h 后，观察制冷喷雾剂和水凝胶对皮肤刺激性的影响。如图5 所示，在任何时间点，大鼠的皮肤组织中都没有红斑或水肿，这表明在使用制冷喷雾剂或水凝胶治疗后，皮肤组织没有过敏表现。

图5 使用制冷喷雾剂和水凝胶干预不同时间后皮肤的刺激反应Fig 5 Effects of cryogen spray and hydrogel on skin irritation responses after different times of treatment

2.4 制冷喷雾剂与水凝胶联合应用对烫伤创面的影响

通过比较同一大鼠烫伤的两侧皮肤，发现创面在24 h后皆出现明显水肿和焦痂，经制冷喷雾剂和水凝胶联合处理的创面与未经任何处理的创面或接受自来水处理的创面相比较，其创面焦痂区域显著减少，差异具有统计学意义（图6）。

图6 制冷喷雾剂与水凝胶联合干预对受伤皮肤伤口面积和焦痂区域（红色箭头所示）的影响Fig 6 Effects of cryogen spray combined with hydrogel on the wound and eschar areas in the wounded skin

H-E 染色显示，与未经任何处理的创面，或接受自来水处理的创面相比较，接受制冷喷雾剂和水凝胶干预的创面炎性细胞浸润均减少，且差异具有统计学意义（均P<0.05，图7）。这些数据表明，制冷喷雾剂结合水凝胶可以在一定程度上及时减轻烧伤损伤。

图7 制冷喷雾剂与水凝胶联合使用后受伤皮肤组织学表现（H-E染色，×20）Fig 7 Histological observation of the wounded skin treated by cryogen spray combined with hydrogel(H-E staining,×20)

3 讨论

烧伤可由热、冷、摩擦、化学或电源导致，并可影响皮肤以外的多个器官系统。据统计，烫伤和火焰烧伤占主导因素，家庭是事故最常见的地点，儿童，尤其是5 岁以下的儿童是最常见的年龄组［19］。急救有助于烧伤的有效管理，对烧伤部位进行及时治疗可以阻止热量的持续释放，减少伤口深度和瘢痕形成。如果可行，应尽快进行急救。适当的急救可通过冷却烧伤区域来缓解症状、降低烧伤严重程度以及随后的组织损伤［20-21］。目前权威的急救治疗建议是，在烧伤后3 h 内，用冷自来水（2 ℃和15 ℃之间）冲洗烧伤区域至少20 min。水洗可以冷却组织，稀释有毒物质（酸和碱），减少炎症反应，减少水肿，随后促进伤口再上皮化［22］。在英国和澳大利亚等发达国家，超过50 %的烧伤患者会在现场接受适当的紧急伤口冷却治疗［23］。然而，在中国仅14.76%［24］，并且目前使用的伤口冷却方法也存在一定的不足，例如无法在事故场地附近找到清洁水源，无法在特定身体部位（如颈部、臀部）进行冲洗，在转运就医途中无干净合适的伤口敷料覆盖伤口等。因此，普及烧伤急救知识，开发合适的急救产品，迫在眉睫。

喷雾冷却是一种表皮降温的方法，在皮肤激光外科手术中被广泛用于防止皮肤组织受到不必要的热损伤［25］。喷雾冷却具有许多优点，例如冷却能力高、工作液用量低、工作液和热表面之间的温差小［26］。一项实验研究［27］表明，使用低浓度乙醇添加剂进行喷雾冷却是促进散热、控制表面温度的有效方法。在本研究中，我们开发了一种含有生理盐水溶液和制冷剂（低浓度乙醇）的制冷喷雾剂。细雾中的液体更易挥发，可以瞬间带走大量热量。无菌生理盐水可维持皮肤生理屏障，不刺激伤口；制冷剂所带走的热量远大于自来水洗涤。结果表明，不同浓度的制冷喷雾剂的冷却速度明显高于普通自来水。此外，制冷喷雾剂易于使用，可放置在不同的位置（例如家庭、学校、商场），并可供多人同时使用。总体来说，我们开发的制冷喷雾剂具有良好的冷却效果，并且使用方便。

水凝胶因其良好的生物相容性、高亲水性、离子转运能力以及与细胞外基质相似的结构等许多有益性质而被广泛用于伤口敷料［28-29］。水凝胶敷料可以吸收伤口渗出物并维持湿润的伤口环境［30］。已有多种形式的水凝胶产品用于治疗各种创面。在此项研究中，我们开发了一种聚合物水凝胶，实验证实该水凝胶具有持久的冷却效果。此外，与未经任何治疗或自来水治疗的受损皮肤相比，接受冷冻喷雾和水凝胶治疗的烫伤皮肤中，创面面积和焦痂区域以及炎性细胞浸润显著减少。这些数据表明，冷冻喷雾结合水凝胶是减少早期烧伤损伤的有效方法。

综上所述，我们的研究结果表明，制冷喷雾剂与聚合物水凝胶相结合具有良好的冷却效果，可作为烧伤患者急救管理的有效和方便的工具。下一步将继续研究，以确认其临床应用的可能性。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

伦理批准和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有动物实验均已通过上海交通大学医学院附属瑞金医院动物实验伦理委员会的审核批准（2018.11.16）。所有实验过程均遵照《实验动物管理条例》进行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Animal Experimental Etheics Committee of Ruijin Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，（Dated 11/16/2018）， and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of regulations on the administration of experimental animals.

作者贡献/Authors'Contributions

田鸣、刘琰参与了实验设计；董叫云、宋菲参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by Tian Ming and Liu Yan. The manuscript was drafted and revised by Dong Jioayun and Song Fei.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-24

·Accepted：2022-05-06

·Published online：2022-05-28