基于微流控芯片构建复合力学刺激细胞反应器*

敬灵芝,范苏娜,2,姚 响,张耀鹏,2

(1.纤维材料改性国家重点实验室 东华大学 材料科学与工程学院，上海 201620； 2.济南金泉生物科技有限公司，山东 济南 250101)

0 引 言

伴随着人体运动，不同部位的各组织总是处在各种复杂的力学微环境中[1]。例如，血液的流动将使血管中的上皮细胞和内皮细胞不断受到流体的剪切，剪切力随着血液流速的变化而发生改变[2]；呼吸过程中肺部的收缩与扩张亦会使肺泡上皮细胞处于周期性的拉伸作用中[3]；而存在于膝关节和髋关节等承重关节中的关节软骨在运动过程中则会不断受到关节滑液传递的静水压刺激[4]，诸如此类存在于机体内的力学刺激不胜枚举。

已有诸多研究报道指出细胞在体外对单一的流体剪切[5～7]、拉伸作用[8,9]、压力[10,11]等力学刺激均会做出明显响应，此类力学刺激—细胞响应相关的基础研究工作对诸如动脉粥样硬化[12,13]、肺部炎症反应[14]、骨关节炎[15,16]等疾病的发病机理与治疗方案探索均有重要参考价值。然而，体内的力学微环境往往不是某种力的单一存在。研究复合力学刺激对细胞行为的影响可更为贴切地模拟体内的实际力学微环境。但目前相关的研究报道还相对较少，主要原因很可能在于适宜于细胞培养的相关复合力学刺激设施设备较为缺乏。众所周知，微流控芯片[17,18]简洁小巧、可利用微结构设计准确操控流体，模拟细胞在体内的部分受力情况[19～21]。

综合上述分析，本文拟借助微流控芯片技术及相关基材的表界面修饰技术来构建适宜于细胞灌流培养的微流控通道，进一步整合可控的灌流和压力施加系统来构建对细胞可同时施加流体剪切力和压力的复合力学刺激细胞反应器。此外，通过在微通道中植入压力传感器还可赋予体系实时传感细胞培养通道中实际压力信号的功能。本文拟开发的细胞反应器简便小巧，有望用于研究流体剪切力—压力复合刺激对细胞或微组织行为的影响。

1 试 验

1.1 原 料

聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)预聚物及固化剂(美国Dow Corning公司)；SU—8 2000光刻胶(Microchem)；光纤光栅传感器(上海汉坤光电科技有限公司)；α—MEM低糖培养基(Gibco)；胎牛血清(FBS)(Gibco)；青链霉素双抗(Gibco)；胰蛋白酶(Gibco)；粘附因子(attachment factor)，(Invitrogen)；I型胶原(Collagen I)(杭州欣友生物技术有限公司)；纤连蛋白(fibronectin)，(Roche)；大鼠骨髓基质干细胞(美国澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司)。

1.2 仪 器

匀胶机 TJ800型(北京中科同志科技有限公司)；紫外光刻机 URE—2000/35(中国科学院光电科技研究所)；等离子处理仪 DT—01型(苏州奥米格机电科技有限公司)；细胞培养箱 BB15型(Heraeus)；光纤光栅解调仪(上海汉坤光电科技有限公司)；往复伸缩机 DIY—37GB330型(东莞市秦艺电机有限公司)；酶标仪 MULTISKAN MK3型(ThermoFisher Scientific)；倒置荧光显微镜 DMi8型(Leica)；扫描电子显微镜 SU8000型(Hitachi)；倒置相差显微镜 CKX41SF型(Olympus)。

1.3 微流控芯片及其基材PDMS膜的制备

芯片制备：通过Auto-CAD软件设计绘制微通道图案，打印出掩模版。随后对SU—8光刻胶进行紫外光刻，制得具有通道图案的光刻胶阳模。将PDMS预聚物与固化剂按10︰1的质量比进行混合并搅拌均匀，待混合物消泡后浇注到光刻胶模具上，在70 ℃固化成型30 min，得到复刻有微通道图案的PDMS阴模。对阴模进行打孔(芯片的入口和出口)处理，并将其与PDMS膜片(作为微流控通道的底材)一同等离子处理，封装后得到微流控芯片。

PDMS膜制备：将上述混合物浇注到平整的培养皿中，同样条件下固化成型。成型后，将其裁剪为直径约为20 mm的圆形薄片备用。

1.4 PDMS膜表面与微流控芯片通道内表面的涂覆改性

灭菌：在制备好的芯片通道中注入75 %(体积分数)乙醇，将其与PDMS圆形薄片置于75 %(体积分数)乙醇中浸泡2 h，经磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)清洗后再用紫外照射30 min。

PDMS膜表面的涂覆改性：材料灭菌后置于12孔板中，后分为4组。第一组PDMS膜不做任何处理(对照)，其他组分别加入500 μL粘附因子(AF)、I型胶原(collagen I)和纤连蛋白溶液(fibronectin)，静置涂覆12 h，吸走溶液，备用。粘附因子溶液购自上海骄荣生物科技有限公司(Gibco)；I型胶原溶液通过0.006 mol/mL的乙酸配制，浓度为0.012 g/L；纤连蛋白溶液由无菌超纯水配制，浓度为25 mg/L。

微流控芯片通道内表面的涂覆改性：用注射器吸取活性物质溶液并注入微通道中，静置涂覆12 h，吸走溶液，备用。

1.5 细胞的接种与培养

本文选用大鼠骨髓间充质干细胞(P3—P5)，使用含10 %FBS的α-MEM低糖培养基在37 ℃、5 % CO2的培养箱中培养。接种前，细胞(约长满培养瓶底部80 %)经胰蛋白酶消化得到细胞悬浮液，离心去除消化液，后对细胞进行重悬并计数。

PDMS膜上接种：将细胞悬浮液稀释到105个/mL。吸取等量细胞悬浮液加到置于12孔板底部的PDMS膜上(经不同活性物质预涂覆处理)，每孔500 μL，再补加1 mL新鲜培养液。置于培养箱中孵育2 h后将孔板中的细胞悬液吸弃，再加入新鲜的生长培养液，放入37 ℃、5 % CO2的细胞培养箱中培养。

芯片内接种：将细胞悬浮液稀释到8×105个/mL。用注射器吸取细胞悬浮液注入到芯片通道内(约30 μL/芯片)进行接种，后置于培养箱(37 ℃,5 % CO2)中孵育1天后，通过注射泵注入新鲜培养液。再分别用5,20,60,100 μL/min的流速加以灌流培养，每天灌流6 h，共3天。

1.6 可传感复合力学刺激细胞反应器的搭建

按1.3节中的比例配制PDMS预聚物和固化剂的混合物，并浇注到放有压力传感器(光纤光栅传感器)的光刻胶阳模上固化成型。然后参照1.3节进行芯片封装，便可得到预植有压力传感器的微流控芯片。随后利用优选活性物质纤连蛋白对微通道内表面进行涂覆修饰，实验步骤参考1.4节中内容。

在可传感微流控芯片构建的基础上，结合可控注射泵、往复伸缩机组装流体剪切力—压力复合力学刺激系统。流体剪切力是通过注射泵推进装有培养液的注射器来实现的，通道入口通过导管连接在注射器上，出口由导管接出到收集器以收集排出的培养液。往复伸缩机固定于架子上并置于培养箱上层，标准重物(如砝码)悬挂在伸缩杆末端，可借助往复机的伸缩实现与微流控芯片顶部的接触和分离，进而利用往复机的可控运转来实现对细胞培养体系施加周期性压力刺激的目的。内置的压力传感器结合光纤光栅解调仪，最终实现微流控通道内的实际压力刺激信号的实时传感和读出。

1.7 分析测试

1.7.1 微流控芯片通道截面形貌表征

对封装后的芯片进行切割，并对对应截面进行喷金处理(10 mA，喷金50 s)，随后使用扫描电子显微镜(SEM)在5 kV电压下进行观察并拍摄。

1.7.2 细胞黏附与活力表征

用4 %多聚甲醛固定细胞15 min。然后用DAPI(4 mg/L，染色5 min)和TRITC标记的鬼笔环肽(1 mg/L，染色30 min)分别对细胞核和细胞骨架(F-actin)进行染色。染色完成后，细胞核发蓝色荧光，细胞骨架发红色荧光。随后用倒置荧光显微镜拍摄相关荧光显微照片。

细胞活力通过CCK—8试剂盒进行表征。用CCK—8混合染色液(培养基：胎牛血清：CCK—8试剂=8︰1︰1)处理细胞2.5 h(置于培养箱中孵育)。孵育结束后，吸取染色液到96孔板中，后置于酶标仪上进行吸光度的测定。

使用倒置相差显微镜直接对在微流控芯片通道中灌流培养3天后的细胞进行拍摄记录，以初步评估灌流培养(施加不同剪切力刺激)后的细胞黏附状态。

1.7.3 微流控芯片通道内压力刺激的可传感性能表征

以往复伸缩机加载标准重物50 g砝码为例，通过改变往复伸缩机的频率来评估传感模块对微通道内压力信号的实时传感性能。当往复机不断推拉砝码上下运动时，芯片微通道内的光纤光栅传感器在压力作用下产生形变，光纤内耦合波长发生移动(Δλ)，经光纤光栅解调仪解调并由内置软件计算后便可传输出微通道内对应的压力变化。

2 结果与讨论

2.1 PDMS表面改性对细胞黏附和活力的影响

最为常用的微流控芯片构建材料为PDMS。然而，纯PDMS材料的细胞黏附性能相对较差(如图1(a)所示)，难以直接构建适宜于细胞培养的复合力学刺激反应器。为此，本文首先探索了PDMS的表面改性处理方案，具体选择了三种可促进细胞黏附的活性物质(粘附因子、I型胶原、纤连蛋白)加以涂覆处理。研究结果表明：与不改性的PDMS相比较，纤连蛋白的涂覆改性可非常有效地促进细胞黏附(图1(a))并提升细胞活力(图1(b))；I型胶原的改性作用与纤连蛋白比较相去甚远(图1)；粘附因子的涂覆改性并未明显改善细胞的黏附状况和细胞活力(图1)。综上可知，纤连蛋白为优选的活性物质，因而在后续的芯片微通道内表面的修饰中，将直接利用纤连蛋白进行改性处理。

图1 细胞在不同活性物质改性处理后PDMS基材表面培养1天后的黏附生长情况

2.2 微流控芯片构建与细胞在改性微流控通道内的灌流培养

本文制备的微流控芯片实物照片如图2(b)所示。芯片含部分弯曲通道，可一定程度上增加细胞的黏附培养面积。芯片通道的预设高度为200 μm，宽度为2 mm，由通道截面SEM图可以看出，PDMS材料较为准确地复刻了光刻胶模具的通道图案，且随机选取的通道入口、中段和出口处的微通道参数(宽度、高度等)较为均一，进一步证实本文作者利用PDMS材料成功制备获得了预设参数的微流控芯片。

图2 微流控芯片的设计与实物效果

由于纯PDMS材料表面的细胞黏附与铺展较差(图1(a))，而较差的细胞黏附与铺展将会严重抑制细胞的生长和增殖[22,23]，因而未经修饰处理的微流控芯片难以直接胜任动态细胞灌流培养等的考察。基于2.1节中的改性探索结果，此处直接利用纤连蛋白对芯片微通道内表面改性处理，随后分组进行灌流培养考察，尝试的灌流速度包括：0 μL/min(静态培养)，5，20，60，100 μL/min。灌流培养3天后，典型组别的细胞黏附相差图如图3所示，在60 μL/min流速下，细胞仍然能很好地黏附在通道表面，生长状态良好，与静态培养组相比无明显差异。5 μL/min和20 μL/min流速下的细胞黏附生长情况与60 μL/min类似。然而，当灌流速度提升至100 μL/min后，微通道内的细胞铺展面积明显缩小，铺展形态异常且细胞数量亦明显减少，这很可能是由于灌流速度过大不利于细胞的黏附生长甚至将部分细胞直接冲出微流控通道所致。综上所述，PDMS芯片通道内表面经纤连蛋白改性后可明显提升细胞在通道内表面的黏附能力，这一改性策略成功将本体系可考察的灌流速度上限提升至60 μL/min以上。细胞在微流控通道内的牢固黏附为后续成功搭建复合力学刺激细胞反应器奠定了坚实的技术基础。

图3 细胞在纤连蛋白涂覆改性微流控通道内灌流培养3天后的相差显微照片

2.3 可传感复合力学刺激细胞反应器的搭建及微流控通道内压力信号的可传感性评估

可传感复合力学刺激细胞反应器示意图如图4。

图4 基于微流控芯片构建的可传感复合力学刺激细胞反应器示意

其中，剪切力的大小可通过改变注射泵的推进速率准确调控。微通道内流体剪切力的实际大小可通过如下公式[24]推算

式中μ为灌流液体粘度(细胞培养液粘度约为0.001 Pa·s);Q为灌流液体流速,m3/s;b为通道宽度,m;h为通道高度,m。由此计算可知，本研究所制备的微流控芯片中，60 μL/min灌流速度对应的流体剪切力为0.075 Pa，即0.75 dyn/cm2。

标准重物在微流控芯片顶部的加载可对微通道内的细胞施加压力刺激，压力的大小可通过改变标准重物(如砝码)的质量来调整，压力的施加频率可通过调整往复机的伸缩频率加以调控。此外，通过在微通道中植入压力传感器还可实时传感培养通道中的实际压力信号，结合光纤光栅解调仪的调制及内置软件的计算，输出所测得的压力。光纤光栅解调仪内置软件对压力的计算方式如下

式中 Δλ为波长变化，pm；E为PDMS的弹性模量(1 500 kPa)；k为微应变系数(1.2 pm/10-6)，由此计算获得的压力单位为Pa。

本研究开发制备的复合力学刺激细胞反应器实物如图5所示，该反应器简易小巧，容易放置于细胞培养箱中，非常适于研究流体剪切力—压力复合刺激对细胞或微组织行为的影响。

图5 基于微流控芯片构建的可进行复合力学刺激并实时传感压力信号的细胞反应器实物照片

为了验证该反应器对微通道内压力的可传感性，采取加载标准重物50 g砝码为例，通过改变往复伸缩机的频率来评估传感模块对微通道内压力信号的实时传感性能。往复机先以0.3 Hz的频率周期性施加压力，随后将频率提升至1 Hz，如图6(a)所示。在2.5 s时，砝码下压到微流控芯片顶部并维持3 s，此时，微通道内传感器实际测得的压力也相应增加，从0 Pa增大到约35 Pa并持续3 s(图6(b))。5.5 s时，往复机上拉撤去芯片顶部加载的砝码，微通道内部传感器实测的压力也相应撤销，变为0 Pa。当重复施加压力或改变施加频率时，微通道内传感器实测的压力值也会发生相应改变，且步调和趋势与理论的加载信号高度匹配，如图6所示。由此可见，整合于本反应器中的压力传感系统可及时有效地感知并输出微通道内的实际压力信号。

图6 微流控芯片顶部对应的理论刺激信号与通道内实时传感信号的对比

3 结 论

纤连蛋白对微流控芯片PDMS基材的涂覆改性有效提升了细胞在微流控通道内的黏附和细胞活力，同时将可考察的灌流速度上限提升至60 μL/min以上。此外，通过结合可控的灌流设备和往复伸缩机，本文构建了一种简易小巧的复合力学刺激细胞反应器，可置于培养箱中用于考察流体剪切力—压力复合力学刺激对细胞行为的影响，并实时传感微通道内的实际压力信号。此反应器在复合力学刺激对细胞或微组织行为影响的研究领域具有潜在应用价值。