红小豆上胞囊线虫的发育动态研究

李静，陈井生，郭永霞，3，周园园，3，曹尚

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心；3.黑龙江省作物有害生物互作生物学及生态防控重点实验室；4.重庆三峡学院）

大豆胞囊线虫（Soybean cyst nematode，SCN）病，是危害世界大豆生产的最主要病害之一。研究发现，大豆胞囊线虫的二龄幼虫侵入植物的根系后，会引起根系组织的机械损伤和代谢紊乱，感病的大豆会表现出根系短粗，植株矮化、萎黄和不易结实等症状[1]。大豆胞囊线虫是一种典型的定居性内寄生线虫，对大豆等重要油料作物危害严重。由于线虫分布广泛，生存能力强，危害性大等特点，防治相对困难。大豆胞囊线虫除了对大豆造成危害外，还可以在其它500多个作物种类上寄生。主要为害的作物是豆科，如：菜豆、兵豆、箭舌豌豆、香豌豆、豌豆等[2]。

红小豆（Vigna angularis），学名赤豆，因种皮呈红色，又名赤小豆、朱豆，是豆科一年生、直立或缠绕草本植物。我国的红小豆种植面积和总产量均居世界首位[3]。红小豆营养丰富，富含淀粉、蛋白质、铁、钙、磷、钾等矿物质元素，脂肪含量低。同时现代研究发现，红小豆对人体有显著的抗氧化、护肝护肾、抗癌、降血压降胆固醇、抗菌抗病毒等多种作用。由于红小豆是医食同源作物，且红小豆的价格比主要粮食作物高、投入少，对农民来说，红小豆是重要的经济作物，也是欠发达地区脱贫攻坚的主要收入来源。因此，保证红小豆的产量对于农民来说是非常重要的。近些年，关于红小豆的研究开始逐渐增多[4]。然而，红小豆上的病害逐年增加，每年因病害引起的减产问题十分严重。红小豆上的大豆胞囊线虫病也严重影响了小豆的产量和品质。然而，农民对该病缺乏了解，导致未能及时有效地预防该病，造成不必要的经济损失。现阶段，关于大豆胞囊线虫对红小豆的致病性不明确，在红小豆根内的发育状况尚无报道，大豆和红小豆胞囊线虫的侵染差异也尚不清楚。

大豆胞囊线虫（Heterodera glycines Ichinohe）是一种土传内寄生线虫[5]，是危害全球大豆生产的主要病害之一，由俄罗斯植物病理学家Jaczevski 在中国东北地区首次发现[6]。大豆胞囊线虫由卵孵化，一龄幼虫（J1）在卵内发育，二龄幼虫（J2）在15~30 ℃开始发育[7]，幼虫侵染大豆根并在根内寄生生活[8]，定殖后虫体开始膨大，经过蜕皮，三龄、四龄幼虫出现。雌虫与雄虫交配最后一次蜕皮后，虫体发育为成虫，完成一个世代的发育循环[9]。该病害可使通常会使中国东北大豆产量减少5%~100%[10]。随着大豆种植面积的逐年增加，大豆胞囊线虫病每年给全球造成的经济损失超过16.2 亿美元[11]。大豆胞囊线虫的世代受温度和季节的影响，如果温度条件适宜，它完成一个世代大约需要25~30 d 的时间。由于温度的影响，在北方地区，如东北，大豆胞囊线虫一年可发生3~4 代，第一代历时55 d[12]，在南方一年可发生4~5 代。但是，在不同植物中，其发育周期略有不同。

研究以大豆和红小豆为试验材料，在根部接种二龄幼虫。取样后，用次氯酸钠-酸性品红染色法对根组织中的线虫进行染色，并在体视显微镜下对各龄期的根部线虫数量进行检测和计数，明确大豆胞囊线虫对于红小豆的侵染情况，大豆胞囊线虫在大豆和红小豆根部的发育动态揭示了大豆胞囊线虫在红小豆根部的发育过程和完成一个生活史所需的大致时间，为大豆胞囊线虫在红小豆上的有效防治提供了科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试品种

试验所用的大豆品种为合丰50，由黑龙江省农科院大庆分院提供；

试验所用的红小豆种质资源为北7，由黑龙江八一农垦大学作物育种研究室提供。

1.1.2 供试线虫

试验所用到的胞囊为黑龙江省农科院大庆分院胞囊线虫发病土壤分离获得。胞囊置于自制孵化池中孵化。

大豆胞囊线虫胞囊和J2 的获得如下：

土壤样品采集自黑龙江省农科院大庆分院实验基地，采用改良淘洗-过筛法[13]进行胞囊分离。具体方法是：用2 000 mL 烧杯取适量的大豆根际病土，置于淘洗桶中。加入适量水搅拌均匀。静置10~20 s 后，依次通过堆叠的20 目、40 目、60 目、80 目金属筛，用强水流将金属筛上的杂物从20 目洗至40 目。再将80 目筛上的残留物反复冲洗至水流清为止。于体式显微镜下挑取饱满的胞囊。挑好的胞囊用0.5%NaClO 溶液消毒3~4 min，无菌水冲洗3 次。干燥后，将胞囊储存于4 ℃的冰箱中，备用。

大豆胞囊线虫悬液的制备：将胞囊放入自制的灭菌孵化池，将孵化池置于灭菌的培养皿中，向培养皿中加入适量无菌水，于25 ℃的恒温培养箱中培养孵化，期间更换无菌水，及时收集孵化出的二龄幼虫（J2），置于4 ℃冰箱内备用。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆胞囊线虫感染红小豆田间验证

试验选红小豆种质资源为北7，播种于黑龙江省农科院大庆分院实验基地田间自然发病圃，于胞囊显嚢期，将植株连根挖出，保持根系完整，调查根上胞囊数量。

1.2.2 大豆胞囊线虫接种

采用盆栽试验，用0.5% NaClO 对供试大豆和小豆种子进行表面灭菌3 min，并用无菌水冲洗。将供试大豆种子和红小豆种子用湿润的医用纱布包裹，置于培养皿中，30 ℃条件下催芽，期间及时换水。待种子芽长2~3 cm 左右时，将种子播种于装有经过高温灭菌砂土（体积比1∶2）的黑色塑料钵中。待植株长至两叶期，分别在幼苗根部接种J2 悬浮液约（600 条·mL-1）1 mL。接种后每3 d 取一次样，每次取5 株，进行根组织染色并计数。

1.2.3 植物根组织中线虫的染色并计数

参照刘维志[14]方法，采用NaClO-酸性品红对侵入根组织内的线虫进行染色，将洗净的植株根系置于1.5%NaClO 溶液中浸泡5 min 后，用清水冲洗30 s以便去除根系表面残留的NaClO，于蒸馏水中浸泡15 min。将根系转入盛有酸性品红的100 mL 的烧杯中，煮沸1~5 min，冷却后用自来水冲洗根系表面的残留的品红，然后转移到盛有100 mL 酸性甘油（甘油中加几滴5 mol·L-1HCl）的烧杯中加热褪色1~5 min，于体视解剖镜下镜检大豆和红小豆根内线虫的数量及发育动态。

1.2.4 数据统计与分析

分别计算每颗大豆根组织和红小豆根组织中的各虫态数量，即群体密度；统计各取样时期各虫态的平均群体密度，并利用origin 2018 软件对数据进行统计分析。

2 结果分析

2.1 红小豆外部症状

大豆胞囊线虫侵染红小豆后红小豆的整株症状和地下部症状见图1，可以看到大豆胞囊线虫侵染红小豆后，红小豆地上部叶片缺绿，植株矮小，根系发育不良，主根长势弱，根部着生大量白色胞囊。

图1 大豆胞囊线虫危害红小豆植株的症状Fig.1 Symptoms of soybean cyst nematode endangering adzuki bean plants

2.2 红小豆根组织染色观察结果

图2 是红小豆根内不同龄期线虫，图A 为接种后5 d 时红小豆根内的二龄幼虫（J2），虫体细长线条状，寄生在红小豆根内维管束中；图B 为接种后10 d时红小豆根内的三龄幼虫（J3），虫体逐渐膨胀呈腊肠状；图C 为接种后20 d 时红小豆根内的四龄幼虫（J4），虫体继续膨大，呈豆荚状；图D 和E 接种后28 d 时红小豆根内的雌虫和雄虫，雌雄虫形态不同，雌虫呈柠檬形或近圆形，雄虫呈细长蠕虫状，弯曲盘绕在红小豆根组织内。

图2 不同龄期线虫在红小豆根内发育情况Fig.2 The development of nematodes at different ages in the roots of Adzuki bean

2.3 大豆和红小豆根组织中大豆胞囊线虫的群体动态

大豆和红小豆根组织中大豆胞囊线虫J2、J3、J4的群体密度变化见图3。由图3（a）可知，在3 d 时，在大豆和红小豆根组织中均已出现二龄幼虫，根内侵染的线虫数量分别为25.8 条·株-1和20.0 条·株-1。在大豆的根组织内，J2 群体密度在第9 天时出现高峰，为55.4 条·株-1，此后J2 数量开始减少，18 d 时最少。而在红小豆根组织中，J2 群体密度在第12 天时最大，为87.6 条·株-1，此后数量逐渐减少，18 d 时数量最少。

由图3（b）可知，J3 在大豆和红小豆根组织中都最早出现在第6 天，侵染数量分别为0.2 条·株-1和1.4 条·株-1。在大豆根组织中，J3 群体密度在第12 天时达到高峰，侵染数量为60.4 条·株-1；此后J3 数量减少，持续到第27 天。在红小豆根组织中，J3 群体密度在第18 天时出现高峰，数量为49.8 条·株-1，此后J3 数量减少，持续到第27 天。

由图3（c）可知，大豆和红小豆根组织中的J4 都出现在18 d，侵染数量分别为2.4 条·株-1和5.4 条·株-1。在大豆的根组织中，J4 群体密度在第24 天时出现高峰，为35 条·株-1；此后J4 数量开始减少，至30 d 为8.2 条·株-1。在红小豆根组织内，J4 群体密度在第24 天出现高峰，为32 条·株-1；此后数量开始减少，至30 d为2.4 条·株-1。

图3 大豆和红小豆根组织中大豆胞囊线虫的群体动态Fig.3 Population dynamics of soybean cell cystic worms in soybean and Adzuki bean root tissue

2.4 大豆和红小豆根组织中大豆胞囊线虫的发育动态

大豆和红小豆根组织中大豆胞囊线虫J2、J3、J4的发育动态变化见图4。大豆和红小豆根内线虫在接种3 d 后开始侵入，均为J2 幼虫。接种6 d 后，大豆和红小豆根内开始出现J3，但仍以J2 幼虫为主。接种9 d 后，大豆根内J2 的数量达到了峰值，为55.4 条·株-1。接种12 d 后，红小豆根内J2 幼虫最多，为87.6 条·株-1，大豆根内的J2 幼虫开始减少，J3 幼虫数量增加并且达到高峰，数量为60.4 条·株-1。

从图4 可以看到，9 d 后大豆根内和红小豆根内J2 的数量开始减少，并且都是在接种后第6 d 检测到J3，18 d 检测到J4，说明从J3 发育到J4 约9 d。但是在大豆根组织内J3 在第12 d 达到发育高峰，J4 在24 d 时达到高峰，在大豆根组织中J3 发育高峰到J4 发育高峰历经12 d；在红小豆根内J3 在第18 d时达到高峰；J4 的发育高峰在24 d，在红小豆根组织中J3 发育高峰到J4 发育高峰历经6 d。可以看出红小豆根组织中J3 到J4 的发育时间较短，大豆根内大豆胞囊线虫的发育进程要长于红小豆根内的大豆胞囊线虫。

图4 大豆和红小豆根组织中大豆胞囊线虫的发育动态Fig.4 The developmental dynamics of soybean cell cystic worms in soybean and Adzuki bean root tissue

2.5 大豆和红小豆根组织中大豆胞囊线虫发育时间的确定

由图3（d）可知，大豆在接种后21，24，27，30 d检测到成熟雌虫，且在30 d 是部分大豆根组织内还有未发育完成的雌虫。红小豆在接种后21，24，27 d检测到成熟雌虫，在第30 天时部分红小豆根组织内已无成熟雌虫。说明在研究中，在大豆根组织内，大豆胞囊线虫二龄幼虫发育为成熟雌虫大约需要21~30 d 以上的时间，而在红小豆根组织内，大豆胞囊线虫二龄幼虫发育为成熟雌虫大约需要21~27 d 的时间。但这只代表部分发育较快线虫完成其生活史所需要的时间，不能代表线虫的一个发生世代。

3 讨论

大豆胞囊线虫病是危害大豆产量的一个重要因素，大豆胞囊线虫侵染大豆根系引起病害，导致大豆植株矮化发黄，影响产量[15]。研究表明，大豆胞囊线虫寄主范围广，能侵染大部分豆科植物以及一些豆区不常见植物[11]，研究通过对大豆和红小豆上大豆胞囊线虫侵染情况进行比较分析，发现大豆和红小豆根组织中大豆胞囊线虫的群体动态不同，红小豆上J2的群体密度高峰大于大豆上的J2 的群体密度，且在红小豆根系中大豆胞囊线虫各虫态发生量均明显较高，因此，在条件适宜的情况下，大豆胞囊线虫在红小豆上的发病程度不次于大豆。红小豆种植面积不断加大，线虫病害发生日趋严重，但该病害发生于植株根部，常常被人们忽视，因此，对该病害的有效防治也越来越重要。

在中国，大豆胞囊线虫在大豆上1 年发生3~4或6 代。在美国明尼苏达州南部大豆上大豆胞囊线虫能够完成3~4 代[16]。在研究中，从大豆和红小豆根组织中大豆胞囊线虫J2、J3、J4 的发育动态变化可以看到，J2、J3 在红小豆中的出现高峰都比大豆要晚，而J4 出现的高峰要早。可知红小豆中J3 到J4 的发育时间较短。究其原因，大豆胞囊线虫对不同寄主的适合性和致病性存在差异[17]，研究中，大豆胞囊线虫对红小豆侵染这方面的探讨未见报道，大豆胞囊线虫对大豆和红小豆的侵染存在一定的差异，适宜条件下，红小豆内的大豆胞囊线虫发育更快，更快的出现雌虫，并进入下一个侵染循环。

在22~23 ℃下，SCN 完成1 个世代需要21~27 d[18]，Niblack 等[19]指出，理论上大豆胞囊线虫在1 个大豆生长季可以完成6 代，具体代数主要取决于寄主适合性、播种时间、杂草寄主状况和土壤温度等条件。试验对大豆和红小豆根组织中线虫染色，镜检各龄期线虫数量发现，大豆内的大豆胞囊线虫完成第一个生活史大概需要21~30 d。这与已报道的大豆胞囊线虫完成一个世代为21~27 d 的结论一致[20]。研究表明，在接种J2 后21、24、27 d，在红小豆中检测到成熟雌虫，而在红小豆根组织内，大豆胞囊线虫二龄幼虫发育为成熟雌虫大约需要21~27 d 的时间。因此，适宜条件下，红小豆内的部分发育较快的大豆胞囊。

国内外对于大豆上大豆胞囊线虫的侵染、发育动态、发生世代的报道有很多，人们知道大豆胞囊线虫是如何侵染大豆、线虫的发生世代以及对于大豆上大豆胞囊线虫的防治方法[21]。但是对于红小豆上的大豆胞囊线虫的侵染、发育动态的研究未见报道。研究明确了大豆胞囊线虫对于红小豆的侵染情况，并根据大豆胞囊线虫在大豆和红小豆根内的发育动态，明确了红小豆根内线虫的发育进程，为有效防治红小豆上的大豆胞囊线虫病提供了理论依据。

4 结论

红小豆上的大豆胞囊线虫的研究国内一直未见报道，说明农民对于红小豆上大豆胞囊线虫的危害并不清楚，研究证明了大豆胞囊线虫会造成红小豆地上部叶片缺绿，植株矮小，根系发育不良，主根长势弱。因此，对于红小豆上大豆胞囊线虫病的防治不可忽视。药剂防治大豆胞囊线虫时，要结合线虫各龄期的发育情况。掌握好使用药剂的时间，才能达到理想的防治效果[20]。控制大豆胞囊线虫虫口密度的关键时期是在线虫侵染第一个高峰期出现时[22]，根据研究数据表明，线虫侵染红小豆的第12 d 是J2 数量的高峰，由于试验接种的是已经孵化出的二龄幼虫。因此，田间防治红小豆上的大豆胞囊线虫病时，应在红小豆出苗后及时调查，加强防治，以保证防治达到理想效果。