MICM综合分析在骨髓增生异常综合征诊断中的应用效果*

陈思宇，彭贤贵，杨武晨，邓小娟，张 曦，王 平

陆军军医大学第二附属医院血液病医学中心，重庆 400037

骨髓增生异常综合征(MDS)是起源于造血干细胞的克隆性髓系异质性的疾病，其特点是造血功能异常，表现为单系或多系外周血血细胞减少，高风险向急性髓系白血病(AML)转化[1]。目前，MDS诊断主要依靠骨髓涂片(BMS)细胞形态学和细胞遗传学[2]，然而MDS的发生、发展是一个动态变化的过程，某一时间点难以完全明确诊断，诊断率仅70.48%[3]。目前，骨髓病理活检、流式细胞免疫学、分子生物学等新技术逐渐应用于MDS诊断，多技术联检虽然提高了MDS的诊断率，但因实际临床工作中送检组合不一致，不同诊断技术的观察分析侧重不同，各自独立报告，极易导致MDS诊断结果不一，甚至相互冲突。本研究对MDS多技术送检情况及各技术诊断MDS的问题进行分析，利用细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学(简称MICM)综合分析修正诊断MDS，以期为临床提供精准有效的实验诊断依据，现将具体结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2021年1月至2021年12月就诊于该院血液病医学中心的60例外周血细胞减少(至少1系血细胞减少)且骨髓细胞形态学疑诊为MDS的患者作为研究对象。60例疑诊为MDS患者年龄17～84岁，中位年龄59岁；男女性别比例为1.72∶1.00；白细胞计数为2.57×109/L(1.58×109/L，3.95×109/L)，红细胞计数为2.35×1012/L(1.92×1012/L，2.73×1012/L)，血红蛋白为70 g/L(65 g/L，85 g/L)，血小板计数为42×109/L(12×1012/L，116×1012/L)。所有患者经临床需求不同程度完善骨髓活检(BMB)、流式细胞免疫学(FCM)、细胞遗传学(CGM)、分子生物学等检测。本研究获得本院伦理委员会批准，以及所有受试者的知情同意。

1.2方法

1.2.1MDS检测及诊断标准 (1)血液系统肿瘤和急性白血病分类参照WHO 2016版标准[4]进行；(2)BMS细胞形态特点和骨髓象诊断意见参照《血液病学诊断及疗效标准》[5]，骨髓活检(BMB)在髂后上棘进行，长度不少于1.5 cm，观察造血组织面积与增生度、红系病态造血与异位、粒系病态造血与异位、巨核系发育异常与计数、肥大细胞计数、静脉窦内骨髓浸润现象、网硬蛋白纤维染色等，行Gomori银染色和免疫组化，检测标志包括CD34、MPO、GPA、CD61、CD42、CD68、CD20和CD3。病理活检CD34+前体细胞结节/片簇分布且组织面积≥造血细胞面积30%为骨髓病理AML界限。(3)利用流式细胞术(FCM)积分系统(FCSS)[6]对MDS进行积分，主要包括以下抗体：CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD33、CD13、CD117、CD15、CD11b、CD64、CD34、HLA-DR、CD14、CD56、CD16、CD38、CD45及同型对照。当FCM诊断FCSS积分≥2分时考虑MDS。(4)细胞遗传学检测主要包括染色体核型和荧光原位杂交技术(FISH)。染色体核型异常按人类细胞遗传学国际命名体制[ISCN(2020)]描述，FISH检测MDS常见异常荧光探针包括5q31、CEP7、7q31、CEP8、20q、CEPY。(5)基因突变检测流程参照《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识(2018年版)》[7]，MDS检测项目包括TP53、TET2、DNMT3A、IDH1/2、EZH2、ASXL1、SRSF2、RUNX1、U2AF1、SETBP1等。

1.2.2MICM 综合分析 MDS不同检测技术的诊断由对应领域中级职称者报告，然后由3名从事血液系统疾病诊断20余年的高级职称病理医生进行MICM综合分析。MDS诊断参照《骨髓增生异常综合征中国诊断与治疗指南(2019年版)》[8]中的标准。其中血细胞减少的标准为中性粒细胞绝对值<1.8×109/L，血红蛋白<100 g/L，血小板计数<100×109/L。

1.3评价指标 (1)MDS诊断技术(BMS、BMB、FCM、CGM)的一致性；(2)MICM综合分析与BMS、BMB、FCM、CGM检测的特异度、灵敏度和准确度。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0统计学软件对研究数据进行分析，其中计量资料以M(P25,P75)表示，BMS、BMB、FCM、CGM检测MDS的灵敏度、特异度、准确度采用率表示，组间比较采用χ2检验，采用Kappa检验判断多种检测方法与形态学结果对MDS诊断的一致性，以Kappa>0.750为一致性较好。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

MICM综合分析显示，60例疑似MDS患者中，BMB 检测MDS 58例、FCM 检测MDS 57例、CGM检测MDS 54例、二代测序技术(NGS)检测MDS 34例，见图1。以最终临床诊断为依据，60例患者中，6例未完成MICM综合检测，MDS无法明确诊断。Kappa检验结果显示，与BMS诊断的比较，BMB、FCM和CGM结果支持MDS诊断的一致性较差(Kappa=0.076、0.344、0.099，均<0.750)。54例患者得到最终诊断，MICM综合分析与不同技术的灵敏度和特异度见表1。54例MICM综合分析患者中，明确诊断MDS 42例(其中3例MDS经BMB检测发现骨髓纤维化，3例MDS经FCM检出单克隆B淋巴细胞)，5例经BMB或FCM诊断为急性髓系白血病(AML)，2例经FCM诊断为淋巴母细胞淋巴瘤伴骨髓增生异常改变，5例MDS证据仍然不足，进入临床观察随访。

注：MLD为多系病态造血，RS为环形铁粒幼细胞，SLD为单系病态造血，EB为原始细胞增多;柱状图中的数字为MDS亚型对应例数。

表1 MICM综合分析与BMS、BMB、CGM诊断MDS的相关参数(n=54，%)

3 讨 论

MDS发病机制至今尚不明确，疾病特征、临床表现及实验室检查均具有明显的异质性，给诊断带来一定的困难。目前，MDS的诊断仍然主要依靠骨髓细胞形态学诊断，在判断细胞病态造血表现、原始特征和种类及细胞分化阶段上易受操作者主观判断[9]，其诊断结论常常受到临床质疑。随着病理活检、流式细胞免疫学、分子生物学等新技术的应用，MDS诊断的准确度得到明显提升。虽然MICM各技术的应用取得了长足的进展，部分纳入了MDS诊断或预后分层中，但目前并没有形成一个标准的诊断体系。

MDS的诊断是一个复杂的过程，目前MDS诊断指南[4]中提出的最低诊断标准依赖细胞形态学和遗传学。细胞形态学被认为是MDS诊断的重要依据，BMS形态检有利于骨髓细胞病态情况的观察，但在观察骨髓造血全貌和 MDS分型诊断中准确率并不高[10]。有文献报道，细胞形态学是基于显微镜下可辨识的细胞形态学异常，诊断率为70.48%[3]，本研究中BMS诊断率为74.07%，高于文献[3]报道，可能与本研究中选择对象的偏倚有关。有研究指出，骨髓穿刺活检利于骨髓组织变化(如骨小梁变化、骨髓坏死，以及纤维化、胶样化等)的观察，并且检测过程受骨髓细胞与基质黏附力和纤维化程度等的影响较小[11]，可弥补部分BMS和外周血形态检测的不足，但其单独检测对MDS及其分型诊断的灵敏度、特异度仍较低，本研究中BMB诊断的灵敏度为84.62%，高于文献[11]报道，可能原因是本中心BMB为血液病诊断专科平台并具有较深厚的细胞形态学基础。FCM是一种高灵敏检测技术，虽还没有纳入MDS诊断标准，有研究显示，FCM检测细胞发育异常的灵敏度高于细胞形态学分析[12-13]。CHU等[14]提出，FCSS能很好地弥补国际预后积分系统(IPSS)和世界卫生组织分型预后积分系统(WPSS)的缺陷。本研究中,FCM运用FCSS诊断的特异度和灵敏度较高，更重要的是FCM的MDS误诊率更低，仅为33.33%。主要原因是FCM能够鉴定MDS原始细胞克隆性，免疫表型分析可判断原始细胞的良恶性质及系别，补充细胞形态学对原始细胞比例小于5%的鉴别难点，尤其原始细胞过氧化物酶阴性的情况。目前，MDS克隆性造血标志主要依赖非随机染色体核型异常，异常核型的检出对MDS的诊断具有重要价值[15]。在本研究中，MDS相关染色体异常发生率为40.74%，与文献[16]报道大致相同。染色体异常的出现可能早于形态异常，细胞遗传学发生与MDS相关的畸变，对MDS的早期诊断具有重要意义。但是核型异常并非MDS所特有[17]。因此，核型异常需联合血细胞病态造血形态学特征及其他临床等特征综合判断。

BMS、BMB、FCM、GCM、NGS在MDS诊断中均体现出不同程度的诊断价值，由于患者经济负担和医院项目开展等原因，临床怀疑MDS的患者进行MICM联合检测的项目并不完全。各技术诊断MDS的一致性较差(Kappa<0.750)，Kappa从高到低依次为FCM、CGM、BMB(Kappa=0.344、0.099、0.076)。MDS诊断技术中，BMS和FCM在病态造血和细胞发育显示明显优势，诊断率分别74.07%、70.37%，BMB和CGM次之。尽量选择MDS高诊断率技术进行联合检测，在MDS二联诊断中，BMS+FCM联合可能更优于BMS+BMB和BMS+CGM组合。本研究结果显示，MICM综合分析明显优于单一诊断，MICM对MDS诊断灵敏度为95.35%，特异度为90.91%，准确度为97.62%。本研究中，MICM综合分析修正了15例(27.77%)骨髓细胞形态学的疾病诊断和MDS分型，降低了漏诊率(4.65%～14.89%)及误诊率(9.09%～28.57%)。

MICM综合分析利用流式免疫学在系别分型上的优势，观察到3例MDS伴单克隆B淋巴细胞增加，2例MDS的初诊纠正为淋巴瘤伴继发性MDS改变；对于低增生性 MDS 和 MDS 伴有骨髓纤维化的患者只能通过BMB切片才能诊断。在预后评估方面，骨髓纤维组织的有无及增生程度与MDS的克隆增生性相关，是独立的不良预后因素[18]。本研究依然将骨髓或外周血形态学诊断的髓系原始细胞比例≥20% 定义为形态学诊断AML标准；补充病理活检CD34+前体细胞结节/片簇分布且组织面积≥造血细胞面积30%，修正形态学原始细胞<造血细胞面积20%为AML界限。本研究中，有5例形态学诊断MDS-EB2，经BMB显示原始细胞CD34+前体细胞满足AML条件，其中2例FCM粒、单、红三系发育异常诊断，综合修正为MDS转化的急性髓系白血病(MDS-AML)或急性髓系白血病伴骨髓增生异常相关改变(AML-MRC)。结果未见待排MDS病例中经细胞遗传学观察涉及5q-、7q-等细胞遗传学改变，当形态学未达到标准(一系或多系细胞发育异常比例<10%)，但同时伴有持续性血细胞减少的患者，如检出具有MDS诊断价值的细胞遗传学异常，应诊断为MDS未分类型(MDS-U)[4]，进而修正诊断。因此，多技术MICM综合分析能够不同程度修正MDS的形态学诊断。骨髓病理活检对MDS伴骨髓纤维化或AML的诊断具有特殊价值，FCM表型分析是确定原始细胞来源的金标准，可以鉴别淋巴瘤骨髓侵犯伴髓系病态造血；经典的染色体核型异常是诊断病态造血现象不完全满足标准的MDS克隆证据。

综上所述，MDS的实验诊断技术各有优劣，多技术联合检查能够提高MDS诊断率，可降低骨髓形态学等单一技术的误诊率，MICM是一种高效能的综合分析方法。然而，MDS是一个动态的发生、发展的过程，某一时间点的MICM有时仍不能完全诊断，追求更高灵敏度和特异度需要纳入NGS等新技术并结合临床进行分析。同时，尚需建立MICM综合分析MDS的应用规则，收集更多临床病例进行效果验证。