干扰素α-1b联合人免疫球蛋白对EB病毒感染患儿临床疗效及对Ficolin-3、SH2D1A表达的影响*

宋昆泽，李雅莉，牟 建

三二〇一医院：1.儿科；2.微生物及免疫科，陕西汉中 723000

临床上，儿童EB病毒(EBV)感染较为常见，多表现为咽峡炎、淋巴结肿大等，严重时可造成心、肝等器官损伤，危及生命。目前EBV感染患儿尚无特异性的治疗方法，主要予以更昔洛韦、抗菌药物及对症支持治疗等[1]。有研究表明，部分患儿在更昔洛韦治疗中会出现骨髓抑制的现象，表现为白细胞及血小板减少等，导致患儿免疫力低下[2]。因此，提高EBV感染患儿治疗疗效，减少不良反应发生是临床研究的重点。重组人干扰素α-1b联合人免疫球蛋白能中和毒素，杀死细菌和病毒，其用于小儿毛细支气管炎等疾病治疗已取得一定成效，在治疗EBV感染过程中能发挥免疫调节及抗病毒的双重作用[3]。但是，重组人干扰素 α-1b联合人免疫球蛋白用于治疗EBV感染患儿的时间较短，且关于二者免疫调节的机制及疗效判断的指标报道较少。纤维胶凝蛋白3(Ficolin-3)是参与补体凝集素途径中的重要蛋白，可识别细菌及病毒等多种微生物，在免疫反应中具有重要作用[4]。SH2结构域蛋白1A(SH2D1A)基因定位于Xq25，SH2D1A可与信号淋巴细胞激活分子结合，影响SH2结构域的信号转导分子SHP-2的募集，参与调节免疫细胞的功能[5]。有研究表明，EBV感染患儿Ficolin-3、SH2D1A表达升高，二者表达情况与患儿病情严重程度有关[6-7]。因此，本研究分析重组人干扰素α-1b 联合人免疫球蛋白治疗对EBV感染患儿的临床疗效，以及对Ficolin-3、SH2D1A表达水平的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年2月至2020年2月在本院就诊的130例EBV感染患儿作为研究对象。收集患儿一般资料，记录患儿住院期间临床症状及体征的消退时间。纳入标准：(1)参考《诸福棠实用儿科学》[8]中EBV感染诊断标准；(2)临床表现和血清学抗体EBV-DNA、EBV-CA-IgM 及EBV-NA-IgG检测结果提示EBV活动性感染。排除标准：(1)接受常规治疗或人干扰素α-1b联合人免疫球蛋白治疗以外其他治疗方案患儿；(2)伴严重神经及器官功能损害患儿；(3)存在药物禁忌证或不愿意接受相关诊治患儿。根据治疗方式不同将入选患儿分为对照组和观察组，各65例。观察组和对照组性别、年龄和病程等比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究经本院医学伦理委员会批准，患儿家属签署知情同意书。

表1 两组一般资料比较

1.2仪器与试剂 荧光定量PCR(RT-qPCR)仪购自美国ABI公司，型号ABI7500。流式细胞仪购自美国贝克曼公司，型号CytoFLEX。人Ficolin-3 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自泉州睿信生物公司(货号：RX2918)，白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒购自江莱生物公司(货号：JL14113、JL13943、JL13317)，Ficoll淋巴分离液购自美国SIGMA公司(货号：26873-85-8)。RNA快速提取试剂盒购自新海基因公司(货号：B0132)，引物序列由华大基因公司合成。

1.3方法 对照组给予常规治疗，包括营养支持、补液纠正水电解质及酸碱失衡、抗感染治疗等对症支持治疗，以及阿昔洛韦(陕西博森生物制药有限公司，国药准字H20052277)静脉滴注治疗，给药剂量为5 mg/kg，12 h 1次，治疗1周。观察组在常规治疗基础上给予人干扰素α-1b联合人免疫球蛋白治疗，人干扰素α-1b 注射液(北京三元基因药业公司，国药准字S20010006)给药方式为肌内注射，给药剂量为5 μg/kg，每天1次，持续给药1周，人免疫球蛋白(华兰生物工程有限公司，国药准字10970032)给药方式为静脉滴注，给药剂量为400 mg/kg，治疗5 d。两组患儿均治疗5～7 d，7 d后评估疗效。

1.4观察指标

1.4.1ELISA检测血清Ficolin-3、SH2D1A表达 取各组治疗前及治疗后清晨空腹静脉血。ELISA检测血清Ficolin-3表达。采用RT-qPCR检测外周血单个核细胞SH2D1A表达。采用密度梯度离心法分离患儿治疗前后外周血单个核细胞，RNA提取试剂盒提取总RNA。将RNA逆转录为cDNA后进行PCR反应。SH2D1A上游引物为5′-AGGCGTGTACTGCCTATGTG-3′，下游引物为5′-TGCAGAGGTATTACAATGCCTTG-3′；GAPDH上游引物为5′-GCACCCACATGGCACGAATTTT-3′，下游引物为5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。按照说明书配制反应体系，反应条件：95 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性20 s，60 ℃ 退火20 s，70 ℃延伸30 s，共40个循环。Ficolin-3、SH2D1A表达结果以相对定量法2-ΔΔCt表示。

1.4.2免疫分子及免疫细胞检测 采用ELISA双抗体夹心法检测血清IL-6、IL-8、TNF-α水平，采用流式细胞术检测外周血CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+。采用RT-qPCR检测治疗前后两组EBV-DNA、EBV-CA-IgM及EBV-NA-IgG，并计算转阴率。

1.4.3疗效评估及并发症发生情况 疗效评估[3]：根据患儿治疗后症状、体征和实验室检测指标进行疗效评估，患儿的症状、体征加重，实验室指标恶化时判断为治疗无效；当患儿EBV感染的临床症状和临床体征完全消失，并且EBV感染相关的实验室检测指标正常时判断为显效；症状、体征较治疗前改善，实验室检测指标好转但未达到正常时判断为有效。总有效率=(显效例数+有效例数)/总例数×100%。并发症：观察患儿治疗过程中有无心肌酶异常、肝功能异常及胸腔积液等并发症发生情况。

2 结 果

2.1两组治疗后症状及体征比较 治疗后，观察组发热、咳嗽、颈淋巴结肿大、咽痛、扁桃体肿大和肝脾肿大各临床症状及体征的消失或消退时间均短于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组症状及体征消失或消退时间比较

2.2两组治疗后病毒转阴率比较 治疗后，观察组EBV-DNA转阴率、EBV-CA-IgM 转阴率均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组EBV-NA-IgG转阴率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组病毒转阴率比较[n(%)]

2.3两组治疗前后免疫指标比较 两组治疗后Ficolin-3、SH2D1A、IL-6、IL-8、TNF-α、CD8+均较治疗前明显降低，观察组上述指标较对照组降低更为明显，差异均有统计学意义(P<0.05)；两组治疗后CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均明显高于治疗前，观察组上述指标较对照组升高更为明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两组治疗前后免疫分子水平比较

组别nIL-8(pg/mL)治疗前治疗后TNF-α(pg/mL)治疗前治疗后CD3+(%)治疗前治疗后对照组65174.26±31.3038.87±11.23a254.53±33.60110.69±21.58a73.11±5.6376.36±6.71a观察组65173.55±29.5831.41±10.19a255.71±34.1894.66±22.79a74.42±5.5981.21±7.30at0.1333.9660.1984.1181.3313.944P0.894<0.0010.843<0.0010.185<0.001

组别nCD4+(%)治疗前治疗后CD8+(%)治疗前治疗后CD4+/CD8+治疗前治疗后对照组6516.23±5.2427.57±5.53a58.24±7.3542.14±6.61a1.39±0.311.54±0.34a观察组6517.04±5.36133.87±6.45a59.24±7.3333.23±5.78a1.40±0.301.74±0.36at0.8715.9780.7778.1810.1873.256P0.385<0.0010.439<0.0010.8520.001

2.4治疗前Ficolin-3、SH2D1A表达与各项免疫指标的相关性 相关性分析显示，治疗前Ficolin-3表达与IL-6、IL-8、TNF-α及CD8+呈正相关，与CD3+、CD4+及CD4+/CD8+呈负相关;SH2D1A表达与IL-6、IL-8及TNF-α水平呈正相关，与CD3+、CD4+及CD4+/CD8+呈负相关。见表5。

表5 治疗前血清Ficolin-3、SH2D1A表达与免疫指标的相关性

2.5两组临床疗效及并发症发生情况比较 观察组显效、有效和无效分别为36例、27例和2例，对照组分别为30例、22例和13例。观察组治疗总有效率[96.92%(63/65)]明显高于对照组[80.00%(52/65)]，差异有统计学意义(χ2=9.119，P=0.003)。观察组发生心肌酶异常3例，肝功能异常2例，胸腔积液1例；对照组心肌酶异常7例，肝功能异常10例，肺不张1例，胸腔积液2例；观察组并发症总发生率[9.23%(6/65)]明显低于对照组[30.77%(20/65)]，差异有统计学意义(χ2=9.423，P=0.002)。

3 讨 论

人体在感染EBV后，B淋巴细胞首先受累，受累的B细胞抗原性的异常改变会诱导CD4+T细胞的增殖活化，抑制被EBV感染的B细胞的增殖，调节局部的炎性反应，但同时CD4+T细胞也被消耗而减少[9]。此外，大量EBV抗原的刺激使CD8+T细胞过度增殖活化，CD8+T细胞的细胞毒作用不仅杀伤EBV感染的B细胞，还侵犯心、肝及肾等多个器官，导致重要脏器发生组织病理学改变。T淋巴细胞活化会促进单核-巨噬细胞分泌促炎性细胞因子，如IL-6、IL-8及TNF-α等，造成组织器官的炎性损伤[10]。Ficolin-3是补体凝集素途径中的起始因子，结合病原体后参与补体激活，在宿主防御感染中起关键作用，在EBV感染的急性炎症期间表达明显升高[8,11]。SH2D1A是近年来发现的能够调节免疫细胞功能的重要因子，广泛存在于T和B淋巴细胞等免疫细胞中，当免疫细胞活化后SH2D1A表达明显上调，进而调节周围免疫细胞的功能。有学者报道，SH2D1A在儿童EBV感染时表达明显升高，并导致患儿细胞免疫功能紊乱[7]。

目前，EBV感染患儿的治疗原则主要是对症治疗，疾病急性期主要注意休息，辅以抗病毒治疗，合并细菌感染的患儿予以抗菌药物治疗，但临床疗效有限。干扰素α-1b是一种低相对分子质量的蛋白质，在人体中主要由单核细胞及淋巴细胞分泌产生，不仅参与调节机体的正常免疫功能的调节，在抗病毒方面也具有明显的治疗效果[12]。干扰素α-1b能够诱导细胞产生抗病毒蛋白，促进病毒mRNA降解，并抑制病毒蛋白的转录、翻译和复制过程，从而提高抗病毒治疗效果[13]。人免疫球蛋白在临床上常用于细菌或病毒感染性疾病，其能提高机体的体液免疫，减轻过度的炎性反应，在机体免疫监视、免疫防护、免疫自稳等过程中发挥重要的功能[14]。本研究中，与对照组比较，采用干扰素α-1b 联合人免疫球蛋白治疗的观察组总有效率明显高于对照组，且患儿临床症状消失或消退时间短、病毒转阴率高、并发症总发生率较低，差异均有统计学意义(P<0.05)。分析其原因:一方面，人免疫球蛋白能够抑制抗原、抗体复合物的形成，降低器官组织的炎性反应，改善EBV感染患儿的临床症状[15]；另一方面，观察组患儿治疗后自身免疫功能有所提高。EBV感染的发病机制复杂，机体免疫功能紊乱是导致炎性反应进行性加重及疾病发生、发展的重要原因。CD3+T淋巴细胞是机体介导细胞免疫功能的主要成分，包括CD4+T淋巴细胞亚群和CD8+T淋巴细胞亚群。正常情况下，CD4+和CD8+的数量和功能处于动态平衡，维持机体正常的免疫应答；在病理情况下，细胞免疫功能紊乱，表现为CD4+T淋巴细胞功能抑制，CD8+T淋巴细胞功能激活。CD4+/CD8+是评价机体细胞免疫功能的重要指标，也可作为反映EBV感染患儿病情轻重的客观指标。本研究中，观察组治疗后IL-6、IL-8、TNF-α及CD8+降低，CD3+、CD4+及CD4+/CD8+升高，表明干扰素α-1b 联合人免疫球蛋白能够提高患儿的细胞免疫功能，促进患儿疾病恢复。杨婷等[16]研究表明，干扰素α-1b 联合人免疫球蛋白治疗能够通过诱导细胞凋亡等多种机制抑制效应性T细胞，改善对腺病毒性重症患儿的细胞免疫及体液免疫状态，提高临床治疗的疗效，与本研究结果一致。IL-6、IL-8、TNF-α是机体重要的促炎因子，一定程度上能够反映机体炎性反应及组织损伤严重程度。本研究结果发现，干扰素α-1b 联合人免疫球蛋白能够明显降低IL-6、IL-8、TNF-α水平，从而减轻炎性反应，与其他文献报道一致[3]。

本研结果发现，与对照组比较，观察组在接受干扰素α-1b 联合人免疫球蛋白治疗后Ficolin-3、SH2D1A表达明显降低(P<0.05)，表明Ficolin-3、SH2D1A是反映干扰素α-1b 联合人免疫球蛋白治疗效果的潜在指标。分析其原因：干扰素α-1b 联合人免疫球蛋白治疗可能通过抑制补体凝集素途径的过度激活，抑制T、B细胞的过度活化，恢复患儿机体正常免疫功能，改善EBV感染患儿的临床治疗效果[17]。有研究亦证实，干扰素能够通过抑制适应性抗病毒免疫反应，抑制补体凝集素通路的过度激活，发挥治疗作用[18]。本研究中相关性分析发现，Ficolin-3、SH2D1A与IL-6、IL-8、TNF-α及CD8+呈正相关，与CD3+、CD4+及CD4+/CD8+呈负相关，提示Ficolin-3、SH2D1A表达水平有助于反映EBV感染患儿机体免疫功能状态，是新的免疫相关分子标志物。

综上所述，对EBV感染患儿应用干扰素α-1b联合人免疫球蛋白进行治疗能够缩短患儿症状持续时间，降低Ficolin-3、SH2D1A的表达，改善患儿免疫功能，提高治疗有效性，值得临床关注。