精液中miR-34b、miR-122、miR-429联合检测对男性不育症的诊断价值

陈雨晴，李 剑，靖小珍，姚文瑛△

上海交通大学医学院附属第九人民医院：1.检验科；2.实验中心，上海 201901

有研究显示，大约15%的夫妇在无保护措施的性交1年后无法受孕[1]。在20%的不孕夫妇中，男性因素是唯一的原因，在另外30%～40%的不孕夫妇中，男性因素是促成因素[2]。基本的男性不育症评估需要全面的病史和精液分析，仅其中一项不能准确区分不明原因的男性不育症，因此，分子无创检测可以为医生提供有价值的信息，进一步对不明原因的男性不育症进行评估和诊断[3]。此外，仅通过组织学工作评估睾丸组织标本的传统测试，在检测和分类精子生成障碍方面的准确性和敏感性都不高[4]。miRNA是一类短(20～23个核苷酸)的单链非编码核苷酸，能够通过mRNA降解或翻译抑制来调节基因表达[5]。miRNA参与了各种生物过程，如增殖、分化、发育和凋亡[6]。有报道显示，miRNA表达模式的改变与不同的人类睾丸组织病理学模式、生精功能障碍有关[7]。因此，精液miRNA可以作为评估人类男性生育状况的特定生物标志物。基于此，本研究通过高通量测序检测精液中miRNA表达水平，探讨精液中miRNA表达水平对男性不育症的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入2019年4月至2021年4月本院收治的168例男性不育症患者，其中20例通过高通量测序分析其精液中miRNA表达水平，年龄23～39岁，平均(32.45±6.23)岁；另外148例为研究组，年龄22～41岁，平均(32.54±5.29)岁。排除标准：(1)采集精液前接受任何治疗的患者；(2)肿瘤患者；(3)全身性自身免疫性疾病患者；(4)严重心、肝、肾功能损害者；(5)长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者；(6)有明确的生殖器外伤史、感染史者。同时纳入在本院体检的168例男性健康志愿者，其中20例用于高通量测序分析miRNA表达水平，年龄22～39岁，平均(33.26±8.01)岁；另外148例作为对照组，年龄21～42岁，平均(32.69±5.31)岁。各组年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究获得受试者知情同意及本院伦理委员会批准。

1.2方法 所有受试者收集精液前禁欲2～7 d，手淫法采集第一次射出的精液作为标本。使用Trizol法抽取168例男性不育症患者和168例男性健康志愿者精液中的miRNA，其中20例健康志愿者与20例男性不育症患者精液用于miRNA高通量测序(北京诺禾致源科技股份有限公司)，148例健康志愿者148例男性不育症患者精液用于本研究其他分析。miR-34b、miR-122、miR-429引物由北京擎科生物技术有限公司合成。miR-34b的引物序列：上游引物为5′-TGCGGTCAATCACTAACTCC-3′，下游引物为5′-CGTGCAGGGTCCGAGGT-3′; miR-122的引物序列：上游引物为5′-GCCGTGGAGTGTGACAATGGT-3′，下游引物为 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′; miR-429的引物序列：上游引物为5′- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG-3′，下游引物为 5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。采用北京拜尔迪生物技术有限公司实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒(货号：DEM202-200T)和ABI7500仪器进行qPCR。参考说明书设置反应条件:95 ℃ 15 min(预变性)，然后94 ℃ 15 s(变性)，55 ℃ 30 s(退火)，70 ℃ 30 s(延伸)，共40个循环，绘制最终熔解曲线。miRNA的相对表达水平由公式2-ΔΔCt计算。

2 结 果

2.120例健康志愿者与20例男性不育症患者精液中miR-34b、miR-122、miR-429的表达水平 高通量测序发现，20例健康志愿者与20例男性不育症患者精液中多种miRNA的表达水平有一定差异，其中表达上调的miRNA有58个、表达下调的miRNA有22个，见图1。选取测序结果表达水平差异最大的10个miRNA，并且使用qPCR进行验证，结果发现两组受试者精液中miR-34b、miR-122、miR-429的相对表达量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 20例健康志愿者与20例男性不育症患者精液中多种miRNA的表达情况

表1 两组受试者精液中miR-34b、miR-122、miR-429相对表达水平比较

2.2精液中miR-34b、miR-122、miR-429检测对男性不育症的诊断价值 ROC曲线分析显示，miR-34b、miR-122、miR-429单独诊断男性不育症的灵敏度和特异度见表2。

表2 精液中miR-34b、miR-122、miR-429诊断男性不育症的ROC曲线相关参数

2.3精液中miR-34b、miR-122、miR-429对男性不育症的联合诊断 患有男性不育症的为真阳性，未患男性不育症的为真阴性。miR-34b的阳性临界值为0.460 5，miR-122的阳性临界值为0.586 6，miR-429的阳性临界值为0.667 7，以三者之一阳性为联合诊断阳性，反之则为联合诊断阴性。精液中miR-34b、miR-122、miR-429联合对男性不育症的诊断的灵敏度为96.62%(143/148)，特异度为91.22%(135/148)，准确度为93.92%(278/296)。

3 讨 论

目前，精液中还没有可靠的分子标志物用于男性不育症的伴随诊断[8]，在睾丸活检评估中也缺乏用于常规组织学诊断的标志物[9]，而具有不同精液和组织病理学损伤的患者中miRNA 表达谱的改变可能为诊断提供新的生物标志物[10]。本研究旨在分析临床上可用于评估男性生育状态的miRNA生物标志物。除了作为生物标志物的潜力外，miRNA在精子发生过程中的生物学作用也越来越得到认可。有研究已在雄性生殖细胞和支持细胞中鉴定出许多睾丸特异性miRNA，其中一些 miRNA在精子发生的减数分裂后期高度表达[11]。本研究发现，男性不育症患者与健康志愿者精液中miR-34b、miR-122、miR-429的相对表达量差异有统计学意义(P<0.05)。精液中miR-34b、miR-122、miR-429单向诊断男性不育不孕的灵敏度分别为91.89%、93.92%、92.57%，特异度分别为93.24%、94.59%、93.24%。与青春期前睾丸相比，miR-34b 在成人睾丸中高度表达，表明其在雄性生殖细胞分化中的潜在作用[12-13]。类似地，miR-122 主要在减数分裂后的生殖细胞中表达并抑制过渡蛋白2的转录。过渡蛋白2是一种睾丸特异性蛋白，参与精子发生过程中的染色质重塑[14-15]。这些研究表明，鉴定出的 miRNA 不仅可以作为潜在的生物标志物，而且其可能在精子发生过程中发挥关键作用。更好地了解已鉴定的miRNA 的生物学作用将有助于提高其作为生物标志物的价值。除了miR-34b、miR-122、miR-429，本研究发现的健康志愿者与男性不育症患者精液中其他差异miRNA在男性不育症中的作用值得进一步探索。

综上所述，精液中miR-34b、miR-122、miR-429可作为男性不育症的潜在生物标志物。