基于lncRNA NEAT1与Nrf2/ARE通路研究荣筋拈痛方延缓膝骨关节炎软骨退变作用机制

付长龙，谢新宇，邱志伟，黄艳峰，金灵璐，李西海

1 福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122；2 福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州 350122；3 福建中医药大学中西医结合学院，福建福州 350122

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种因生物因素及力学异常等引起关节结构与组织形态紊乱，致使膝关节功能退变乃至丧失的关节疾病［1］。其显著的病理表现为关节软骨变性、退化，滑膜炎性浸润以及继发性骨赘形成，临床常表现为患膝关节的慢性疼痛、屈伸活动不利等症状，病程后期还可出现关节活动受限甚至致残，严重危害中老年人的健康［2-3］。KOA 归属于中医“膝痹”范畴，其病位在骨，历代医家认为其病机主要与肝、肾亏虚，筋骨失养等密切相关，病机属性为本虚标实，本痿标痹，故对其治则宜行补肾柔肝、除痹消痛之法［4-7］。

课题组前期从《清宫配方集成》中筛选治疗KOA 的高频、核心用药组方，以中医“肝主筋、肾主骨”理论为核心，重新组方成荣筋拈痛方。该方经国医大师陈可冀院士审定，由牛膝、当归、独活、羌活、防风、甘草组成，用于临床治疗KOA 具有良好疗效［8］。通过计算机分子模拟技术分析发现，荣筋拈痛方治疗KOA 的作用机制可能与核因子NF-E2 相关因子/抗氧化元件（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE）信号通路相关［9］。KOA软骨受炎性因子影响导致软骨中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达升高从而激活Nrf2/ARE 通路。其中，Kelch 样ECH 相关蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）是Nrf2/ARE 通路中的关键调控因子，激活通路后引起下游血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、NAD（P）H醌氧化还原酶-1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1，NQO-1］表达变化。研究证实，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在KOA 病理进程中发挥了重要调控作用［10-11］，其中，lncRNA NEAT1 在骨关节炎软骨中表达上调，并促进软骨细胞凋亡，加剧软骨变性［12-13］。研 究 表 明，lncRNA NEAT1 可 以 调 节Nrf2/ARE 通路［14］。因此，本研究基于前期临床及网络药理学研究基础，观察荣筋拈痛方对KOA 模型大鼠lncRNA NEAT1 及Nrf2/ARE 通路的影响，探讨该方延缓膝骨关节炎软骨退变的机制，为其临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择SPF 级2 月龄雄性SD 大鼠45 只，体质量（300±10）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供［实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005］；饲养于福建中医药大学实验动物中心［使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007］，实行分笼饲养，自由饮水，标准饲料喂养。

1.2 实验药物

荣筋拈痛方颗粒（江阴天江药业有限公司，规格：9.5 g/袋，生产批号：2006001），将其溶于100 mL生理盐水中，配制成浓度为0.095 g/mL 的荣筋拈痛方溶液。

1.3 主要试剂与仪器

苏木素-伊红（北京索莱宝科技有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、RIPA 裂解液（radio immuno precipitation assay）、蛋白上样缓冲液、10×电泳液（上海碧云天生物技术有限公司）；10×Tris-HCl 缓冲盐溶液-吐温（10×Tris buffered saline-tween，10×TBST，北京索莱宝科技有限公司）；Nrf2抗体、HO-1抗体、Keap1抗体、iNOS抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）、NQO-1 抗体（博士德生物工程有限公司），GAPDH（美国Signalway Antibody有限公司）；HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；LncRNA NEAT1（Forward：TGGCTAGCTCAGGGCTTCAG，Reverse：TCTCCTTGCCAAGCTTCCTTC）、GAPDH（Forward：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，Reverse：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC）引物（福州尚亚生物技术有限公司）；微量紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司，NanoDrope 2000）；荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司，CFX96）。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组及动物造模 45 只大鼠适应性喂养1 周后，采用随机数字表法分为空白组和碘乙酸钠组，每组分别15 只、30 只。采用2 %戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，右侧膝关节腔注射20 mg/mL 碘乙酸钠0.05 mL，空白组注射等量生理盐水。术后1 周可见大鼠活动频率下降，驱赶运动时出现跛行，大鼠膝关节肿胀，表明成功复制KOA 模型［15］。造模后的碘乙酸钠组采用随机数字表法分为模型组和荣筋拈痛方组，每组15 只。按临床等效剂量换算［16］，荣筋拈痛方组的灌胃剂量为1.9 g/（kg·d），即0.095 g/mL 的荣筋拈痛方溶液10 mL/d，分早晚2 次灌胃，连续灌胃8周，灌胃剂量依据大鼠体质量每周计算调整；空白组和模型组给予等量生理盐水灌服。

1.4.2 组织取材与处理 末次灌胃结束后，采用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，剪开表皮直至暴露出以右膝关节为中心约3 cm×3 cm 的区域。去除骨组织表面附着的肌肉及各种结缔组织，切开韧带小心打开关节腔，注意刀口避免划伤软骨组织表面。每组随机选择3只切取右侧股骨置于多聚甲醛中固定以备后续HE 染色。收集其余大鼠右膝关节表面的软骨组织，置于液氮中转移至-80 ℃冰箱，以备后续进行基因及蛋白检测。

1.5 观察指标

1.5.1 软骨组织病理改变 采用HE 染色法观察各组大鼠右膝软骨组织病理改变情况。常规制备大鼠股骨内侧髁组织石蜡标本，组织切片后进行常规脱蜡复水，苏木精浸染10 min，流水轻柔漂洗1 min，快速返蓝（1%盐酸乙醇溶液）2 s，再经0.5%伊红染液浸染5 s，封固（中性树脂）后进行镜下观察并拍照。

1.5.2 软骨组织Nrf2/ARE 通路蛋白表达情况 采用Western blot 法检测各组大鼠软骨组织中Nrf2、HO-1、NQO-1、Keap1、iNOS 蛋白含量。提取各组软骨组织总蛋白，BCA 蛋白定量，配制12%分离胶和5%浓缩胶，上样后进行电泳，采用半干式进行转膜，脱脂牛奶封闭2 h 后洗膜，再将各条膜放入预先配置好的Nrf2、HO-1、NQO-1、Keap1、iNOS 的一抗中置于4°C 冰箱摇床过夜进行充分震荡反应，次日取出一抗，洗膜后加入二抗，待二抗反应处理后，使用ECL 发光液进行显影，于凝胶成像仪下进行曝光成像，最后分析储存。

1.5.3 软骨组织lncRNA NEAT1 表达情况 采用实时PCR 法检测各组大鼠软骨组织中lncRNA NEAT1表达水平。将软骨组织研磨后，采用Trizol 法提取总RNA，微量紫外分光光度计检测各样本RNA浓度（g/L）和A260/A280 值。根据反转录试剂盒说明书，取1 μg 总RNA 反转录成cDNA，反转录条件：55 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃。以1 μL cDNA 为模板扩增lncRNA NEAT1。扩增反应条件：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 个循环。以GAPDH为内参照基因，计算目的基因2-ΔΔCt，比较分析各组lncRNA NEAT1水平变化。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布，数据采用（±s）表示，组间比较采用方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t法；若方差不齐，两两比较则采用Games-Howell 法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠软骨组织病理改变情况

HE 染色结果显示，空白组大鼠软骨组织切线层连续且完整，细胞质及其基质成分分布均匀且着色浅红，移行层中软骨细胞纵向条索状分布且排列规律，辐射层、钙化层结构完整且清晰；模型组软骨组织切线层发生破坏，纤维方向出现偏移、变薄，软骨细胞外露且抱团簇集生长，移行层与辐射层的软骨细胞呈无序分布排列状态，部分软骨细胞出现钙化，钙化层软骨细胞钙化现象明显，钙化层与软骨下骨间的黏合线起伏较大，且连续性部分中断；荣筋拈痛方组的切线层与关节面基本平行且完整，移行层、辐射层、钙化层及其他层次相对清晰可辨。见图1。

图1 软骨组织HE染色图（×200）Figure 1 HE staining results of cartilage tissue(×200)

2.2 3 组大鼠关节软骨组织中Nrf2/ARE 通路相关蛋白表达比较

Western blot 结果显示，与空白组比较，模型组Keap1、iNOS 蛋白表达明显升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，荣筋拈痛方组Keap1、iNOS蛋白表达明显更低（P＜0.05），Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达明显更高（P＜0.05）。这提示荣筋拈痛方可上调Nrf2 信号及抗氧化信号分子表达，下调促氧化信号分子表达。见表1、图2。

表1 3组大鼠关节软骨中Nrf2/ARE通路相关蛋白表达比较（±s）Table 1 Comparison of Nrf2/ARE pathway related protein expression in articular cartilage in three groups（±s）

表1 3组大鼠关节软骨中Nrf2/ARE通路相关蛋白表达比较（±s）Table 1 Comparison of Nrf2/ARE pathway related protein expression in articular cartilage in three groups（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

组别空白组模型组荣筋拈痛方组n333 Keap1/GAPDH 0.560 5±0.059 5 0.932 6±0.063 91）0.659 5±0.089 12）Nrf2/GAPDH 0.292 3±0.043 9 0.103 6±0.021 11）0.198 8±0.036 52）HO-1/GAPDH 0.559 2±0.042 1 0.313 0±0.025 11）0.627 1±0.040 82）NQO-1/GAPDH 0.880 3±0.170 3 0.404 7±0.067 11）0.692 9±0.063 62）iNOS/GAPDH 0.386 1±0.016 1 0.853 5±0.015 81）0.553 4±0.042 72）

图2 3组大鼠关节软骨中Nrf2/ARE通路相关蛋白条带图Figure 2 Protein strip diagram of Nrf2/ARE pathway indicator in articular cartilage in three groups

2.3 3 组大鼠关节软骨组织中lncRNA NEAT1 水平比较

Real-time PCR 结果显示，与空白组比较，模型组lncRNA NEAT1 水平明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，荣筋拈痛方组lncRNA NEAT1 水平明显降低（P＜0.05）。见表2。

表2 3组大鼠关节软骨组织中lncRNA NEAT1水平比较（±s）Table 2 Expression of lncRNA NEAT1 in articular cartilage in three groups（±s）

表2 3组大鼠关节软骨组织中lncRNA NEAT1水平比较（±s）Table 2 Expression of lncRNA NEAT1 in articular cartilage in three groups（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group, 1) P＜0.05; compared with the model group,2)P＜0.05.

组别空白组模型组荣筋拈痛方组n333 NEAT1/GAPDH 1 1.799 8±0.085 11）1.451 6±0.109 52）

3 讨 论

3.1 KOA 大鼠关节软骨退变可能与氧化应激反应有关

本研究结果显示，HE 染色可观察到模型组大鼠软骨变薄、细胞无序分布，这提示模型组关节软骨发生明显退行性改变，与GUZMAN 等［17-18］研究一致。此外，本研究结果显示，模型组软骨组织中lncRNA NEAT1 水平升高，Keap1、iNOS 蛋白含量显著升高，Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白含量显著降低，提示氧化应激反应参与KOA 大鼠关节软骨退变。这可能与以下因素有关：①生理条件下软骨中低水平ROS 有助于维持软骨细胞稳态及功能，而KOA 软骨受到炎性因子诱导后iNOS 表达高度上调并产生大量的ROS。过量ROS 会激活核因子κB 途径增加炎症，同时抑制细胞外基质合成并诱导基质降解蛋白酶表达，诱导软骨细胞凋亡最终导致软骨降解［19-21］。②过度产生ROS会导致软骨细胞氧化应激，激活以Nrf2/ARE通路为代表的抗氧化应激防御系统。Keap1具有氧化还原感受器功能，非氧化应激时与Nrf2 结合，氧化应激时则与Nrf2 解离引起下游HO-1、NQO-1 表达升高以及时清除过量的ROS，产生抗氧化效果［22-23］。而KOA 软骨中Nrf2 表达失调，同时HO-1、NQO-1 表达受炎症因子抑制，不能有效清除细胞中的过量ROS，最终导致关节软骨降解［24］。③Nrf2/ARE 通路的表达也同时受非编码RNA 的调控［25］。其中lncRNA NEAT1 在OA 软骨中高表达，且与调节Nrf2/ARE通路相关［26-27］。lncRNA NEAT1 调节的Nrf2/ARE 信号通路是延缓KOA 软骨退变的潜在途径。

3.2 荣筋拈痛方延缓KOA 大鼠软骨退变可能与Nrf2/ARE通路抗ROS作用有关

本研究结果表明，与模型组比较，荣筋拈痛方组大鼠关节软骨退变程度明显减轻，lncRNA NEAT1表达水平下调，Keap1、iNOS 蛋白含量明显降低，Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白含量明显升高，这提示荣筋拈痛方延缓KOA 大鼠软骨退变可能与Nrf2/ARE 通路抗ROS作用有关。这可能与以下因素有关：①荣筋拈痛方干预后，软骨组织中iNOS 表达显著降低，细胞中ROS 的产生减少，从而缓解氧化应激反应，延缓OA 软骨退变。②HO-1、NQO-1 是Nrf2 的下游靶蛋白，其表达上调有助于抵抗细胞氧化应激带来的损伤［28-31］，荣筋拈痛方作用于Nrf2/ARE 通路，下调Keap1表达，上调Nrf2蛋白表达，调节下游HO-1及NQO-1，通过清除过量ROS、缓解软骨组织氧化应激达到延缓OA软骨退变的疗效。③荣筋拈痛方干预下调软骨组织lncRNA NEAT1 表达，进而调节Nrf2/ARE 通路，促使Keap1 蛋白表达降低，Nrf2、HO-1及NQO-1蛋白表达升高，增强Nrf2/ARE 通路抗ROS 作用以缓解软骨氧化应激，延缓OA 软骨退变。

4 小 结

荣筋拈痛方在延缓KOA 大鼠软骨退变方面具有一定疗效，其机制可能与其下调lncRNA NEAT1水平，上调Nrf2 信号及抗氧化信号分子表达，下调促氧化信号分子表达，抑制氧化应激水平有关。本研究仍存在一些不足，如lncRNA NEAT1 调节Nrf2/ARE 通路的作用机制尚不明确，还需在后续研究中进一步验证明确。