猕猴桃褐斑病病情调查及病原菌鉴定

邹玉萍，王仁才，崔丽红，王 琰

（1.湖南农业大学园艺学院，湖南 长沙 410128； 2.湘西民族职业技术学院，湖南 吉首 416001； 3.湖南生物机电职业技术学院，湖南长沙 410127）

湖南省是我国猕猴桃主要栽培地及原产地之一，全国40%以上的野生猕猴桃资源都在湖南［1］。湖南栽培的主要猕猴桃品种有“米良1号”和“翠玉”。近年来，随着市场需求的不断扩大，“红阳”猕猴桃在湘西、长沙、永州等地成为主要栽培和推广的品种［2］。据调查，截至2021年，湖南全省猕猴桃栽培总面积超过了2.47万hm2，总产量达35万t，总产值达20亿元，其中湘西地区猕猴桃栽培面积为1.53万hm2，长沙地区栽培面积为180hm2［3］，湘南的江华县栽培面积为187hm2。湖南省主要通过专业合作社与种植大户相结合的方式发展猕猴桃产业，全省共有243个专业合作社。猕猴桃产业已成为湖南乡村振兴的主要产业之一［1］，在进一步提高乡村人民生活水平中发挥着巨大的作用。由于猕猴桃的市场需求扩大，种植面积不断增加，猕猴桃病害的发生也越来越频繁，病害种类也有所增加。病害的发生不仅造成了猕猴桃果实品质下降，还极大地降低了其产量，使得果农经济损失严重，猕猴桃产业的发展受到限制。猕猴桃褐斑病是为害猕猴桃叶片的主要病害，发病严重时造成叶片大量枯死、提早脱落，枝干干枯，果实脱落，严重影响猕猴桃植株光合作用和树体的生长发育及果实品质［4］。近年来，猕猴桃褐斑病在陕西、贵州、四川、江西、广西等地频繁发生，现已有学者进行了相关研究，各学者对不同地区猕猴桃褐斑病病原菌的鉴定结果不同。赵金梅［5］对陕西猕猴桃主产区周至县的中华猕猴桃褐斑病病原菌鉴定为链格孢菌（Alternaria alternative）；Li等［6］将贵州六盘水地区“红阳”猕猴桃褐斑病病原菌鉴定为极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）；吴德义等［7］将猕猴桃褐斑病病原菌鉴定为小球腔菌 （Mycosphaerella sp.）；王明召等［8］对广西猕猴桃褐斑病病原菌叶点霉（Phyllosticta sp.）进行了研究；崔永亮［9］将四川的猕猴桃褐斑病病原菌鉴定为多主棒孢菌（C.cassiicola）。目前关于湖南省猕猴桃病害的研究主要集中于溃疡病［10-11］。笔者对湖南省猕猴桃代表性产区的猕猴桃褐斑病进行了病情调查及病原菌鉴定，以便为其防治奠定基础。

1 调查区概况

2021年5—8月，在湘南、湘中北、湘西等湖南省猕猴桃代表性产区，选择江华、长沙、凤凰等地的4年生猕猴桃果园为调查对象。江华县位于湖南省 南 部，地 处110°25′—112°10′E，24°38′—25°15′N，属于亚热带湿润季风气候区，其年平均气温18～18.5℃。长沙市位于湖南省中部偏北，地处111°53′—114°15′E，27°51′—28°41′N，属亚热带季风气候区，其年平均气温17.2℃。凤凰县位于湖南省西部，地处109°18′—109°48′E，27°44′—28°19′N，属中亚热带季风湿润性气候区，年平均气温15.9℃。各果园均位于坡地，基本情况如表1所示。

表1 各果园基本情况Tab.1 The basic situation of each orchard

2 研究方法

2.1 褐斑病病情调查

调查内容包括“红阳”猕猴桃在不同地区的褐斑病病情、同一地区不同栽培管理水平果园的“红阳”猕猴桃褐斑病病情和同一地区不同品种的猕猴桃褐斑病病情。

采用五点调查取样方法，每点随机调查猕猴桃10株，每株调查50片叶，观察病害的症状。根据病斑大小，将猕猴桃褐斑病病害程度分为0～5级，其分级标准参照 《农药田间药效试验准则（二）》［2］，具体分级标准见表2。同时，计算病株率、病叶率、病情指数，其具体计算方法如下。

表2 猕猴桃褐斑病病害程度分级标准Tab.2 The Classification standard of brown leaf spot on kiw ifruit

2.2 病原菌分离与鉴定

（1）病叶样品采集。调查时于各个果园随机采集5～10片病叶标本，装在自封袋中，贴好标签，放入含有冰袋的泡沫箱中带回实验室于4℃冰箱保存备用。

（2）病原菌分离。采用组织分离法对病原菌进行分离。用自来水将病叶冲洗干净后自然晾干，将叶片的病健交接部分剪下，并剪成边长约5 mm的正方形小叶块。将小叶块在75%的酒精中浸泡5s后转入5%次氯酸钠溶液中浸泡1min，再用无菌水冲洗3次，放置在灭菌滤纸上晾干，随后将小叶块背面朝下接入含氯霉素的PDA培养基上。每个培养皿内放3块小叶块，并摆放成三角形，共接种5皿，放在28℃恒温恒湿培养箱中培养［13-14］。

（3）病原菌纯化。接种1周后，统计不同菌落出现的频率，用接种针挑取不同菌落边缘的菌丝，将其分别接种在新的PDA培养基上培养，观察菌落生长情况，多次转接培养直至培养皿中长出单一菌落得到纯化的菌株后将其保存。

（4）病原菌回接验证。选取新鲜健康无病虫害的猕猴桃叶片进行离体接种试验。用75%的酒精对叶片进行表面消毒，无菌纸擦干后，刺伤处理，将纯化后的菌种用5 mm菌落打孔器打成菌饼接种于猕猴桃叶片上。叶片置于底部铺盖湿棉花和湿滤纸的培养皿中，用保鲜膜密封保湿，放在温度为28℃，湿度为80% ～85%的培养箱中诱导发病。针刺＋菌饼为试验组，针刺＋空白培养基为对照组，每组10次重复，观察发病情况。叶片发病后，再次分离病原菌纯化培养，并选择健康的猕猴桃叶片进行再次离体接种试验。

（5）病原菌形态学鉴定。菌株培养7～10 d后，观察其颜色、形态；用灭菌竹签取少量菌丝放在载玻片上，在显微镜下观察其分生孢子梗、分生孢子等的结构。参考 《中国真菌志》［15］和《植物病原真菌学》［16］等书籍初步鉴定病原菌的属和种。

（6）病原菌分子生物学鉴定。取纯化后长满平板的病原菌，将菌丝刮入装有石英砂的研钵中，研磨成粉末状后装入1.5mL的离心管中，根据试剂盒上的步骤提取病菌DNA。使用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。PCR的反应体系包括：2×Mastermix 12.5μL，浓度为10μmol·L-1的上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR体系的反应条件：在94℃下预变性5 min；95℃条件下变性40 s后退火至47℃保持40 s，之后在72℃条件下延伸150 s，30次循环；最后在72℃下延伸10 min，在4℃条件下回收PCR产物。将扩增的产物点样于1%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳检测、染色。凝胶成像后，送至湖南擎科生物公司进行测序。将测序结果在NCBI数据库中比对相似性，并下载相似度高的序列，然后构建系统发育树，分析供试菌株与同属其他菌株的亲缘关系。

2.3 数据处理

用SPSS 24.0和Excel 2019软件进行数据分析和图表的制作；用MEGA 7.0软件中邻接法构建系统发育树。

3 结果与分析

3.1 猕猴桃褐斑病症状

发病初期叶片上有淡绿色的小斑点，到夏季遇上雨天小斑点扩大成病斑，病斑内部浅灰色，外缘为一圈深褐色，形成一个个外围不规则、内部为灰褐色轮纹状的病斑。随后病斑连接成片，导致叶片大面积变褐、萎焉。

图1 褐斑病田间病害分级标准Fig.1 The standards of diseases grades of brown leaf spot used for field investigation

3.2 猕猴桃褐斑病病情

表3显示：猕猴桃褐斑病在湘南、湘中、湘西北等湖南省猕猴桃代表性产区中普遍存在，调查区平均病株率、病叶率、病情指数分别为76.75%、54.13%、26.31。在不同园区之间，猕猴桃褐斑病的病株率、病叶率、病情指数均存在着较大的差异。江华C园区和凤凰A、B园区猕猴桃褐斑病的病情都非常严重，病株率均达到了100.00%，平均病叶率分别为76.00%、95.00%和74.00%，病情指数分别为33.47、51.83和32.08，其中凤凰A园区的病情最为严重；江华B园区的病情最轻，病株率、病叶率、病情指数分别为2.00%、4.00%、2.67；江华A和长沙B园区的病情较为严重，病情指数分别为27.62和30.37；长沙A和凤凰C园区的病情相对较轻。

表3 各园区猕猴桃褐斑病病情Tab.3 The disease condition of kiw ifruit brown spot

3.3 不同地区“红阳”猕猴桃褐斑病病情

由表4可知：在相同管理水平下，各园区“红阳”猕猴桃褐斑病的病株率达90.00%或90.00%以上。褐斑病的平均病叶率有所差异，其中凤凰园区的病叶率最高，达74.00%；江华园区的病叶率最低，为54.00%。3个园区褐斑病的病情指数无显著性差异，病情均很严重。

表4 不同园区的“红阳”猕猴桃褐斑病病情Tab.4 Brown spot disease of kiw ifruit“Hongyang”in different areas

3.4 同一地区不同栽培管理水平“红阳”猕猴桃褐斑病病情

表5显示：“红阳”猕猴桃褐斑病的病情指数在不同栽培管理水平间均有显著性差异。江华B园区精细化管理的猕猴桃，其褐斑病平均病叶率和病情指数分别为4.00%、2.67，病叶率和病情指数均最低；江华A园区一般化管理和江华C园区粗放式管理的猕猴桃，其病叶率分别为59.00%、76.00%，病情指数分别为27.62、33.47。

表5 不同栽培管理水平“红阳”猕猴桃褐斑病病情Tab.5 The conditions of brown spot disease of kiw ifruit“Hongyang” in different cultivation and management levels

3.5 同一地区不同品种猕猴桃褐斑病病情

表6显示：在长沙园区“翠玉”和“红阳”猕猴桃褐斑病的病株率分别为80.00%和90.00%，“红阳”猕猴桃褐斑病的病叶率和病情指数分别为65.60%和30.37，均明显高于“翠玉”猕猴桃的。在凤凰园区“红阳”猕猴桃褐斑病的病株率、病叶率和病情指数均显著高于“米良1号”的，“红阳”猕猴桃褐斑病的病株率、病叶率和病情指数分别为100.00%、95.00%和51.83，而“米良1号”的仅为44.00%、20.00%和14.91。

表6 不同品种猕猴桃褐斑病病情Tab.6 The conditions of disease in different cultivated kiw ifruit varieties

3.6 病原菌分离及其致病性鉴定

将各果园采回的病叶通过常规的组织分离法共分离出180份菌株。纯化培养后根据菌落形态将其分为6种菌株。对其进行致病性接种试验后发现，仅2种菌株接种后叶片接种部位表现出与田间褐斑病初期相似的症状，即前期接种点中心形成暗绿色小斑点，随后慢慢扩展为褐色或黑褐色不规则斑块。症状如图2-D、图3-D所示。将这2种有发病症状的叶片组织再次分离培养，得到菌株与接种菌株表现相同的菌株，且符合科赫式法则。根据科赫式法则，确定所分离出的2种菌株为湖南猕猴桃褐斑病的致病病原菌，将其分别命名为菌株HNHB-1、HNHB-2。

3.7 病原菌形态学鉴定

菌株HNHB-1在PDA培养基上、28℃下恒温培养3 d，形成浅灰色菌落，菌落直径可达20 mm左右；培养7 d，菌落边缘呈灰白色，直径达50 mm左右；培养10 d，菌丝可长满培养皿，菌落直径达75 mm左右，菌丝均匀，无气味，表面有绒毛。从图2-A、图2-B、图2-E、图2-F可以看出，菌落边缘白色绒毛分布均匀，菌落背面中间灰绿色，边缘灰白色。取少量菌落边缘的菌丝在电子显微镜下观察，结果（图2-G）显示：菌丝具分枝，呈浅褐色半透明状；分生孢子梗直立，部分弯曲且无分枝，有隔膜；分生孢子单生或几个串生为倒棍棒型，具4～20个假隔膜，透明、浅褐色或深棕色。参考 《植物病原真菌学》［16］和Li［17］、Zhu［18］等的研究，初步鉴定病原菌为棒孢属（Corynespora）真菌。

图2 菌株HNHB-1分离鉴定图片Fig.2 The pictures of isolation and identification of strain HNHB-1

菌株HNHB-2在PDA培养基上、28℃下恒温培养13 d后长满了培养皿。从图3-A、图3-B、图3-E、图3-F可以看出，菌落呈圆形或椭圆形、墨绿色，边缘浅绿色，表面有灰白色颗粒状的分生孢子。菌落长满培养皿后，在培养皿中加2 mL灭菌的超纯水，用接种环轻轻地将菌落表面的孢子洗入10 mL离心管中，在4 000 r·min-1离心机下离心5 min，肉眼可见孢子团沉淀如芝麻至绿豆大小，去除多余液体加电镜固定液，常温下固定2 h后用4℃冰袋运输至上海茁彩生物科技有限公司进行电镜透射观察，结果（图3-G）显示：分生孢子为单细胞、无色，壁光滑，圆球形，尾部附有透明附属丝，大小为（9～14）μm×（5～7）μm。初步确定该菌株为叶点霉属（Phyllosticta sp.）真菌。

图3 菌株HNHB-2分离鉴定图片Fig.3 The pictures of isolation and identification of strain HNHB-2

3.8 病原菌分子生物学鉴定

（1）总DNA提取。总DNA电泳结果如图4所示，图中M 为DL5 000 DNA Maker， -为阴性对照；1、2、3、4分别为HNHB-1、HNHB-1.1、HNHB-2与HNHB-2.1菌株；5为分离出的杂菌。

图4 总DNA电泳结果Fig.4 The results of agargelation electrophoresis

（2）系统发育树的构建

根据测序比对结果下载相似性高的菌株和隔代同源性菌株，并选用一个外源菌株，用MEGA 7.0软件进行多序列比对，同时，采用N-J（邻接）法进行系统发育树的构建。进化树如图5和图6所示。

图5 菌株HNHB-1的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of strain HNHB-1

图6 菌株HNHB-2的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strain HNHB-2

图5显示，菌株HNHB-1和接种再分离得到的菌株HNHB-1.1与C.cassiicola聚为一支，基因组高度相似。由此确定，试验分离所得到的猕猴桃褐斑病病原菌为多主棒孢菌（C.cassiicola）。

图6显示，菌株HNHB-2和接种再分离得到的菌株HNHB-2.1与P.capitalensis聚为一支，基因组高度相似。由此确定，试验分离所得到的猕猴桃褐斑病病原菌为叶点霉菌（P.capitalensis）。

4 结论与讨论

猕猴桃褐斑病在湘南、湘中、湘西北等湖南省猕猴桃代表性产区普遍存在，其平均病叶率达54.13%，平均病情指数达26.31；最严重的果园病叶率达95.00%，病情指数达51.83。在各园区，“红阳”猕猴桃褐斑病的病株率和病情指数均很高，且“红阳”猕猴桃的病叶率和病情指数均明显高于“翠玉”和“米良1号”的。根据科赫式法则，结合形态学观察和分子鉴定，确定引起湖南省猕猴桃褐斑病的病原菌是多主棒孢菌和叶点霉菌。

由于发生猕猴桃褐斑病的果园冬季未及时清园，病原菌在土壤和植物病残体里越冬，翌年春天气候回暖后病菌开始侵染，猕猴桃叶片在6月上旬开始发病。湖南省7月高温多雨，病害随即大面积暴发，如防控不当，8月叶片开始提前枯萎凋落。叶片是猕猴桃光合作用的主要场所，叶片的萎焉、提前凋落会造成猕猴桃果实发育不良，营养缺失，口感欠佳，甚至早期落果；同时还会造成猕猴桃结果母枝的养分储备不足，对第二年新梢发育造成严重影响，导致果园产量逐年降低［9］。

冬季在猕猴桃树自然落叶之后，应及时修剪病叶病枝，彻底清园；夏季园内高温高湿，应通过修剪使园内通风透光，减少病害的发生。猕猴桃对水分很敏感，表现出喜湿润、怕旱、不耐涝的特点，因此，要加强肥水管理。 “红阳”猕猴桃抗病性弱，是较为娇贵的猕猴桃品种； “米良1号”和“翠玉”猕猴桃的抗病性较强，其褐斑病的病情较“红阳”猕猴桃的轻。有研究［8］表明，广西猕猴桃褐斑病的病原菌为叶点霉菌；崔永亮［9］发现，引起四川省猕猴桃褐斑病的病原菌为多主棒孢菌，与本试验结果相似。本试验在对病原菌进行致病性接种时，因条件有限，仅采用了室内离体接种法，后期可采用盆栽苗活体接种法进行试验；受时间限制，调查次数太少；由于调查的猕猴桃栽培地均处于山区，海拔高度差相近，未能考虑海拔因素对猕猴桃褐斑病病情的影响。在今后的研究中需扩大调查果园的数量，另外调查时间可连续进行3～4年，以便收集更多信息来研究湖南省猕猴桃褐斑病的病情。本研究虽然确定了湖南省猕猴桃产区褐斑病的病原菌，但引起各地区病原菌不同的原因还有待进一步研究。