兔源大肠埃希菌噬菌体分离鉴定与生物学特性研究

王志鹏，赵 剑，黄 盼，崔雪梅，南 黎，宋厚辉，鲍国连，刘 燕，*

(1.浙江农林大学 动物科技学院·动物医学院，浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室，浙江 杭州 311300； 2.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021)

家兔大肠埃希菌病是由致病大肠埃希菌()及其毒素引起的一种暴发性、死亡率很高的肠道传染病，常与沙门氏杆菌病、梭菌病、球虫病协同作用，导致仔幼兔肠道菌系紊乱，抵抗力降低，严重制约养兔产业的健康发展。抗生素和化学药物是治疗兔大肠埃希菌病的主要手段，但长期使用抗生素易导致细菌耐药性的产生和传播，长此以往，将给养殖业带来严重的经济损失。随着我国畜牧业饲料端禁止使用抗生素和治疗端抗生素减量政策的全面实施，研发新型兽药和抗生素替代品以提高治疗效果、减少抗生素应用，对畜禽养殖业的健康发展和畜产品安全保障来说均具有积极意义。

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。噬菌体可侵入细菌细胞内并产生相应的酶，破坏细胞壁，从而裂解细菌，具有杀菌功能。与抗生素相比，噬菌体制剂具有特异性强、自我增殖快、研发时间短等优势。研究发现，噬菌体不会感染人体细胞，将其用作抗菌剂无明显的毒副作用，不会破坏机体的正常菌群，无引发内毒素血症的风险。本文拟对兔源大肠埃希菌噬菌体进行分离鉴定并开展生物学特性研究，旨在为利用噬菌体治疗兔大肠埃希菌病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与噬菌体样品

噬菌体宿主谱测定涉及的25株大肠埃希菌由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所细菌病研究室分离鉴定并保存；CVCC249、CVCC232和CVCC1495菌株购于国家兽医微生物菌种保藏管理中心。

用于噬菌体分离的大肠埃希菌菌株分离自浙江省内某大型种兔养殖场的临床腹泻样本。兔粪便和污水样本采集自浙江省内多个大型种兔场。

1.1.2 试剂与耗材

胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基，购自美国Oxoid公司；革兰氏染色试剂盒，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；抗生素药敏片、细菌微量生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司。SM缓冲液、PBS溶液、Tris-HCl溶液、磷钨酸、0.22 μm无菌一次性针头式滤器均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 实验动物

35日龄(400±50)g新西兰兔，由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所实验兔场提供。

1.2 大肠埃希菌分离鉴定

1.2.1 大肠埃希菌的分离纯化

用接种环取由腹泻致死兔的回肠样本内容物，在TSA固体培养基上划线接种，置于恒温培养箱37 ℃过夜培养。之后，取透明光滑的菌落继续在TSA固体培养基上进行3次纯化培养。使用革兰氏染色试剂盒对纯化的菌株做初步筛选。

1.2.2 分离菌株的PCR鉴定

分离菌株DNA提取：挑取单个菌落，置于5 mL TSB液体培养基中，37 ℃摇床振荡培养过夜。吸取1 mL新鲜菌液至1.5 mL离心管中，12 000×离心2 min，弃上清，加入1 mL双蒸水(ddHO)重悬，沸水浴中煮沸10 min，12 000×离心10 min，取上清，-20 ℃冰箱保存备用。

参照文献[7]中的方法对细菌进行PCR鉴定。分别以大肠埃希菌16S rRNA的V3～V6区域基因、肠致病性大肠埃希菌LEE毒力岛基因、肠致病性大肠埃希菌Ⅳ型菌毛基因、肠出血性大肠埃希菌志贺毒素基因、肠侵袭性大肠埃希菌Ⅲ型效应子基因、产毒素大肠埃希菌耐热肠毒素/不耐热肠毒素基因、肠聚集性大肠埃希菌聚集黏附菌毛基因序列为模板，设计引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR采用20 μL体系：上下游引物各1 μL，MixDNA聚合酶10 μL，模板2 μL，加灭菌蒸馏水至20 μL。PCR程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反应完成后用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检验。

1.2.3 分离菌株的生化鉴定和药敏实验

按CLSI(美国临床和实验室标准协会)M100-23的要求，用Kirby-Bauer纸片扩散法，根据抑菌圈的直径()判定分离菌株对20种抗生素药物的敏感性，对应标准如下：≥20 mm，敏感(S)；15 mm≤<20 mm，中度敏感(Ⅰ)；<15 mm，耐药(R)。

用细菌微量生化反应管对分离菌株进行生化反应测定。将分离纯化得到的菌株按说明书要求，分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖等生化反应管中，测定分离菌株的生化特性。

1.2.4 分离菌株的致病性测定

选35日龄的新西兰兔用于实验，对照组和感染组各5只。感染组每只兔灌喂1×10CFU·mL分离菌株10 mL，对照组灌喂10 mL PBS溶液，72 h内观察其发病情况。灌喂7 d后，剖检发病兔，观察病理特征，分离病原菌，并进行PCR鉴定。

1.3 噬菌体的分离鉴定

1.3.1 噬菌体分离纯化

样品前处理：将采集的兔粪便样本置于15 mL离心管中，加入0.9%(质量分数)NaCl溶液(以下记为生理盐水)10 mL和采集的污水样本5 mL，4 ℃冰箱过夜，6 000 r·min离心10 min，取上清液，过0.22 μm滤膜除菌，4 ℃冰箱保存备用。

噬菌体扩增与初筛：将1.2节得到的分离菌株按1∶100的比例接种于2 mL TSB液体培养基中，37 ℃恒温摇床培养，每间隔30 min测量1次菌液值，直至=0.2。向摇菌管中加入已过滤的粪便和污水样品各1.5 mL，37 ℃摇床培养过夜。取培养液于2 mL离心管中，4 000 r·min离心10 min，取上清，过0.22 μm滤膜，4 ℃冰箱保存备用。取分离菌株100 μL涂布于TSA平板上，在TSA平板背面画出大小均等的9个正方形格子并进行标号，根据平板标号点滴样品滤液，每个标号方格中滴加10 μL，37 ℃恒温培养箱过夜培养。

噬菌体的双层平板法分离与纯化：取3 g TSB培养基和4 g TSA培养基，加入200 mL去离子水，高压灭菌，制备分离所需的半固体培养基，55 ℃温箱保存备用。将平板出现空斑的样本按照标号找出对应的噬菌体滤液，等比例进行梯度稀释。取10和10的噬菌体稀释液各100 μL与处于对数期的分离菌株混合，37 ℃恒温培养箱孵育20 min。取5 mL半固体培养基加入孵育液中，轻轻混匀，倒入TSA平板中，37 ℃培养过夜，观察噬菌斑。挑取透光度良好、个体较大的单噬菌斑于1 mL SM缓冲液中，混匀后取100 μL与100 μL分离菌株培养液混合20 min，继续用双层平板法培养噬菌体，如此重复3次。

表1 用于大肠埃希菌鉴定的PCR引物序列

1.3.2 噬菌体电镜观察

取纯化的噬菌体液20 μL滴在铜网上，静置10 min，用滤纸在铜网侧面吸取剩余的液体，再在铜网上滴2%(质量分数)磷钨酸10 μL，同样吸取剩余液体，静置干燥后，用飞利浦CM100型透射电镜在100 kV条件下观察噬菌体形态。

1.3.3 噬菌体宿主谱测定

以实验室保存的25株已分离鉴定的大肠埃希菌和3株标准菌株为指示菌，采用点滴法测定噬菌体宿主谱。首先，将冻存的大肠埃希菌复苏培养，取100 μL均匀涂布在TSA平板上，静置干燥后，在TSA平板背面画出大小均等的9个正方形格子并进行标号，将噬菌体分离株根据平板标号进行点滴，每个噬菌体液10 μL，待干燥后，置于37 ℃恒温培养箱过夜培养，观察噬菌斑，对细菌裂解情况进行标注和统计。

1.3.4 噬菌体最佳感染复数测定

感染情况下，噬菌体与宿主菌细胞的数量比值，即每个细胞感染噬菌体的数目被称为感染复数(MOI)。将滴度约为1.0×10PFU·mL的噬菌体液进行连续稀释，分别与培养至对数期的1.0×10CFU·mL的宿主菌按不同比例添加，37 ℃摇床培养，直至噬菌体液滴度为1.0×10、1.0×10PFU·mL的混合物出现澄清液体，滴度为1.0×10、1.0×10PFU·mL的混合物出现少量浑浊液体，滴度为1.0×10、1.0×10PFU·mL的混合物出现浑浊液体为止。将培养物于6 000 r·min离心5 min，收集上清并稀释，采用双层平板法测定噬菌体效价。

1.3.5 噬菌体pH稳定性测定

向存有生理盐水的试管中加入250 μL噬菌体液进行10倍稀释，用稀盐酸溶液和NaOH溶液将噬菌体稀释液的pH值分别调至3、5、7、9，放入37 ℃水浴锅中静置1 h。取每个pH值条件下的噬菌体液100 μL，用双层平板法测定噬菌体效价。

1.3.6 噬菌体热稳定性测定

取1 mL纯化后的噬菌体液于试管中，分别放置于37、42、50、55、60 ℃的恒温水浴锅中，静置1 h后取出，冰浴冷却10 min。每个噬菌体液取100 μL，用双层平板法测定噬菌体效价。

1.3.7 噬菌体一步生长曲线测定

首先，将大肠埃希菌分离菌株培养液按1∶100的比例接种于5 mL TSB液体培养基中，当菌液浓度达到1×10CFU·mL时(≈0.1)，取900 μL菌液与100 μL 1×10PFU·mL的噬菌体液混合，37 ℃恒温孵育10 min。噬菌体充分吸附细菌后，6 000 r·min离心5 min，弃去上清液，将白色沉淀用10 mL TSB液体培养基重悬。对重悬后的噬菌体液进行100倍稀释，37 ℃摇床振荡培养，每隔5 min用双层平板法测定1次噬菌体效价，每个时间点重复3次，取噬菌体效价平均值。以感染时间为横坐标、噬菌体效价为纵坐标，绘制一步生长曲线，计算出噬菌体的潜伏期和裂解量。裂解量=平台期噬菌体效价/潜伏期噬菌体效价。

1.3.8 体外条件下噬菌体对宿主菌的作用效果测定

将噬菌体分离株按最佳MOI(无法扩增的噬菌体液过量添加)与处于对数期的大肠埃希菌分离菌株(≈0.3)混合培养，分别在0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、22、24 h测定值。

2 结果与分析

2.1 大肠埃希菌分离鉴定结果

革兰氏染色镜检结果显示，分离菌株为革兰氏阴性杆状菌，中等大小，单独或成组分布，呈无规则排列，无芽孢(图1)。分离菌株的分子生物学鉴定结果显示，16S rRNA基因V3～V6区的扩增片段长584 bp，基因扩增片段长384 bp，基因扩增片段长224 bp(图2)。分离菌株可发酵和利用多种糖醇，如麦芽糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖和山梨醇等，可产生多种酶，如鸟氨酸脱羧酶等(表2)。对20种常用抗生素的药敏实验结果显示，大肠埃希菌ZJE1株对链霉素、环丙沙星敏感，对头孢噻肟、氟苯尼考和恩诺沙星中度敏感，对其余15种抗生素(包括青霉素、头孢噻吩、庆大霉素等)均耐药，为多重耐药菌(表3)。综上，确定分离菌株为大肠埃希菌，并将其命名为ZJE1。

2.2 大肠埃希菌分离菌株的致病性

图1 革兰氏染色镜检结果Fig.1 Microscopic examination results of Gram stain

M，DL5000 DNA分子量标准；1，16S rRNA基因的V3～V6区；2，stx基因；3，ipaH基因；4，bfpA基因；5，eaeA基因；6，st基因；7，lt基因；8，aatA基因；9，阴性对照。M， DL5000 marker； 1， V3-V6 region of 16S rRNA； 2， stx gene； 3， ipaH gene； 4， bfpA gene； 5， eaeA gene； 6， st gene； 7， lt gene； 8， aatA gene； 9， Negative control.图2 大肠埃希菌分离菌株的PCR鉴定结果Fig.2 PCR identification results of isolated E. coli strain

表2 大肠埃希菌分离菌株的生化鉴定结果

表3 大肠埃希菌分离菌株的药敏实验结果

在感染后的24～48 h，感染组实验兔精神沉郁，采食量减少；72 h，感染组实验兔有1只死亡，其他出现不同程度的腹泻；至7 d，感染组实验兔有4只死亡，仅1只存活，而对照组实验兔均健康存活。全部病死兔剖检显示：脱水，消瘦，腹泻病兔肛门有粪便黏附，个别病兔盲肠出现胀气，小肠各段病变明显，肠腔内液体黏稠，没有发现实质性脏器病变。上述剖检结果为感染大肠埃希菌病后典型的肠段炎症病理变化。对实验病死兔回肠中的病原菌进行PCR检测，分离菌株均扩增出基因和基因，表明ZJE1株对家兔有较强的致病性。

2.3 噬菌体的分离与电镜观察

采用双层平板法，以大肠埃希菌ZJE1为宿主菌分离到4株噬菌体，分别将其命名为噬菌体ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5。

电镜结果显示，噬菌体结构由六角形的头部、可收缩的尾鞘和尾管组成(图3)。头部长度约95 nm，直径约65 nm，尾鞘和尾管长度约为95 nm。初步判定，4株噬菌体均属有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。

图3 噬菌体ZRP2～ZRP5透射电镜图Fig.3 Transmission electron microscope images of bacteriophage ZRP2-ZRP5

2.4 噬菌体分离株的宿主谱与最佳感染复数

ZRP2、ZRP3、ZRP4、ZRP5分别可裂解10、9、3、10种供试大肠埃希菌菌株(表4)。相对地，噬菌体ZRP2、ZRP5拥有较宽的宿主范围。

将分离得到的4株噬菌体与大肠埃希菌ZJE1株分别按照10∶1、1∶1、1∶10、1∶10、1∶10、1∶10的比例混合，测定最佳感染复数。结果显示，噬菌体ZRP2和ZRP3与宿主菌(ZJE1)的感染比为1∶10时，扩增效率最高(表5)，最佳感染时间分别为3.5 h和3.0 h；噬菌体ZRP4在液体中并没有扩增；噬菌体ZRP5与宿主菌的感染比为1∶10时，扩增效率最高。

2.5 噬菌体分离株的pH稳定性与热稳定性

噬菌体ZRP2-ZRP5在4个pH值梯度下的效价结果显示：噬菌体ZRP2和ZRP3在pH为7的条件下存活率超过85%，在pH为3、5、9的条件下，噬菌体全部死亡(图4)；噬菌体ZPR4和ZRP5在pH为7的条件下存活率超过90%，在pH为5的条件下存活率分别为75%和89%，在pH为3和9的条件下，噬菌体全部死亡。

ZRP2-ZRP5在37、42 ℃条件下的存活率接近100%(图5)。之后，随着温度升高，4株噬菌体分离株的存活率均降低：在50 ℃条件下，ZRP2-ZRP5的存活率在55%～70%；在55 ℃条件下，ZRP2-ZRP5的存活率在40%～55%；在60 ℃条件下，ZRP2-ZRP5的存活率急剧下降，不到1%。

2.6 噬菌体分离株的一步生长曲线

一步生长曲线测定结果显示：ZRP2的潜伏期为16～19 min，一个细胞的噬菌体平均裂解量为150个噬菌体(图6)；ZRP3的潜伏期为11～14 min，一个细胞的噬菌体平均裂解量为110个噬菌体；ZRP4的数量没有随着时间扩增；ZRP5的潜伏期为16～19 min，一个细胞的噬菌体平均裂解量为170个噬菌体。

表4 噬菌体宿主谱测定

表5 感染复数测定结果

A，ZRP2；B，ZRP3；C，ZRP4；D，ZRP5。图4 噬菌体分离株的pH稳定性测定结果Fig.4 Survival rate of isolated bacteriophages under different pH

A，ZRP2；B，ZRP3；C，ZRP4；D，ZRP5。图5 噬菌体分离株的热稳定性测定结果Fig.5 Survival rate of isolated bacteriophages under different temperature

2.7 体外条件下噬菌体分离株对宿主菌的作用效果

噬菌体ZRP2～ZRP5感染细菌1 h内，菌液值升高，此时噬菌体与细菌相互吸附；噬菌体感染细菌2～8 h，菌液值总体下降，6 h时菌液值出现不同程度的浮动，噬菌体开始裂解细菌；噬菌体感染细菌8 h后，菌液值上升，细菌开始增长。观察细菌裂解和增殖量发现，噬菌体ZRP4和ZRP5感染后，菌液的平均值显著(<0.05)低于ZRP2和ZRP3组(图7)。

A，ZRP2；B，ZRP3；C，ZRP4；D，ZRP5。图6 噬菌体分离株的一步生长曲线Fig.6 One step growth curve of isolated bacteriophages

图7 不同时间的菌液D600值Fig.7 D600 value of strain solution at different time

3 讨论

致病性大肠埃希菌是常见的人畜共患致病菌，具有多种血清型，一些菌株的毒力因子能直接引起动物肠道感染而引发痢疾、腹泻，甚至导致脱水死亡。家兔大肠埃希菌病常引起沙门氏菌、梭菌和球虫的继发感染，导致肠道菌系紊乱。断奶期幼兔大肠埃希菌病发病率极高，临床上常采用抗生素进行防治，但抗生素的滥用会导致耐药菌株增多，家兔肠道微生物菌群因受到破坏而反复感染疾病，反而可能会给兔大肠埃希菌病的预防和治疗带来更大的挑战。噬菌体作为细菌病毒，利用其自身特异性侵染细菌，并能在细菌细胞内大量增殖，最终将细菌灭杀。噬菌体疗法是利用噬菌体控制或去除细菌感染的一种方法，它的抗菌范围限定于单菌种的某些菌株，对于正常菌群、人体和动物细胞并不造成影响。噬菌体不携带宿主毒力基因，繁殖扩增效率高，易于获取和分离，开发成本低。因此，应用噬菌体治疗细菌病具有明显优势，在替代抗生素治疗上具有潜在的应用前景。

本研究在浙江某兔场腹泻病兔肠道样本中分离到一株大肠埃希菌ZJE1株，用PCR方法扩增出了肠致病性大肠埃希菌的基因和基因。致病性检测发现，攻毒后72 h，实验兔出现不同程度的腹泻和死亡，肠道病理特征与感染大肠埃希菌病后肠段炎症病理变化一致。研究发现，基因和基因能黏附于肠上皮细胞，发生黏附抹平损伤。这种特异性组织病变是导致宿主腹泻的普遍原因。这说明，本试验分离到的大肠埃希菌ZJE1株为肠致病性大肠埃希菌。对20种常用抗生素的药敏实验结果显示，大肠埃希菌ZJE1株对链霉素、环丙沙星敏感，提示这2种抗生素可用于治疗大肠埃希菌ZJE1株感染，对头孢噻肟、氟苯尼考和恩诺沙星中度敏感，对其余15种抗生素(包括青霉素、头孢噻吩、庆大霉素)等均耐药，为多重耐药菌。以ZJE1为宿主菌分离到4株噬菌体，分别命名为ZRP2～ZRP5，在电镜下可明显观察到，噬菌体的结构由六角形的头部，及具有肌病毒科特征的可收缩的尾鞘和尾管组成，与T4噬菌体结构相似。

噬菌体需要具备足够高的滴度、适宜的pH值和温度条件以保持其稳定的活性，根据每株噬菌体的最佳感染复数和感染时间来制备高滴度的噬菌体悬液是保证噬菌体治疗效果的前提。对分离到的噬菌体进行最佳感染复数、pH稳定性和热稳定性检测，其中，噬菌体ZRP2和ZRP3与宿主菌的最佳感染复数最低，为1∶10。噬菌体经口服用于预防与治疗时，可能会受胃酸等外界条件的影响而导致其活性下降。经检测，噬菌体ZRP4、ZRP5在pH值为5～7的条件下能保持较高的活性，噬菌体ZRP2、ZRP3仅在pH值为7的条件下能保持较高的活性，在pH值为3和9的条件下不能存活。这说明，噬菌体在应用时，需解决酸性环境下的稳定性问题，且噬菌体混合物内各株噬菌体应有独立表征，以广泛适应不同的环境。已有研究表明，噬菌体治疗可通过抗酸剂和微囊化包被等方法来增加到达肠道的噬菌体数量。另外，将噬菌体混合物保存于含有0.25%(质量分数)碳酸钙的Tris-SM噬菌体稀释溶液中，经口服后，也可从粪便中回收到高滴度的噬菌体。

噬菌体的宿主特异性主要取决于其尾部蛋白gp37专一性结合细菌表面受体，这些受体以蛋白质、多糖和脂多糖形式存在于宿主菌细胞壁、荚膜、菌毛或鞭毛上，对噬菌体的特异性识别起重要作用。本研究对噬菌体的宿主谱进行检测，结果显示，ZRP2和ZRP5具有广泛的宿主范围，对受试的28种大肠埃希菌菌株(含3株标准菌株)中的10种具有靶向性，其中，ZRP2对1株标准菌株、3株肠侵袭性大肠埃希菌、2株非致病性大肠埃希菌和4株肠致病性大肠埃希菌敏感，ZRP5对1株肠侵袭性大肠埃希菌、8株肠致病大肠埃希菌和1株标准菌株敏感。大肠埃希菌的菌株具有多样性，可考虑使用多种噬菌体的混合物来弥补某些噬菌体宿主谱窄的问题。

本研究筛选的4种噬菌体均可作为大肠埃希菌病防治的候选剂，其中，ZRP5的效价高，宿主范围广，在噬菌体治疗中可优先选择。