镉胁迫对不同甜玉米自交系幼苗生长的影响及其相关简单重复序列分子标记初筛

姜昊梁，黄 允，梁绍芳，谢梦晨，徐天成，宋芷婷，向文文，陈青春，万小荣，孙 伟，*

(1.仲恺农业工程学院 农业与生物学院，广东 广州 510225； 2.广州市特色作物种质资源研究与利用重点实验室，广东 广州 510225)

甜玉米(L.Sturt)是我国重要的特种经济作物，主要用于鲜食、速冻加工和罐头制作等，远销欧美、东南亚等地。南方地区是我国甜玉米的主产区。

据统计，我国平均每年约有1 417 t的镉(Cd)进入农田，其中87%都残留在农田中。另外，化肥的过度施用造成部分土壤严重酸化，导致Cd等重金属离子易被土壤胶体固定而难以降解。镉污染现已成为我国耕地上最严重的重金属污染类型之一。

Cd是生物毒性很强的一种重金属，具有不可逆、化学活性强、毒性持久和移动性大等特点。镉离子通过土壤进入到植物体内并积累到一定程度后，会抑制植物的光合作用和呼吸作用，进而使得植株矮小，叶片发黄，产量和品质降低，严重时甚至导致植株死亡，尤其是在萌发期和苗期，植物对镉离子十分敏感。研究表明，较低浓度的镉离子(<5 mg·L)处理能够促进玉米种子萌发，但随着镉离子浓度增加，会影响胚芽鞘皮层细胞的延展和维管组织的发育，从而影响种子萌发过程，使其发芽率明显降低。高浓度的镉离子(>10 mg·L)处理会破坏细胞内脂质和蛋白质的结构，影响细胞膜的流动性和酶的活性，进而降低根系吸水能力，导致植物含水量和鲜重降低。镉离子胁迫对玉米植株的光合作用和呼吸作用等能量代谢过程有着严重的抑制作用。研究表明，镉离子胁迫不仅影响玉米光合器官发育，破坏叶片光合结构，而且会通过抑制二氧化碳同化、光化学反应和减少气孔数量来降低玉米叶片的光合效率。另外，当镉离子浓度达到一定程度(>50 mg·L)后，会加剧线粒体膨胀，导致内膜结构破坏、功能丧失。除此之外，镉离子作为重金属，它的富集还会影响玉米根系对其他矿质元素的吸收。Tanwir等发现，10～50 μmol·L的Cd胁迫会抑制玉米对Ca、Zn、Fe的吸收和转运，而且这种抑制作用还会随着镉浓度的升高而增加。当然，Cd胁迫条件下对其他离子的限制作用也会受到品种间遗传差异的影响。

广东省是甜玉米生产的大省之一，甜玉米种植面积占全国的50%以上。南方土壤中重金属离子的富集必定会影响甜玉米的生长发育，降低甜玉米的产量和品质，甚至会在一定程度上限制该产业的发展。在水稻、大豆、小麦和油菜等作物上，已有较多关于不同基因型镉胁迫响应差异的研究。但是，在玉米上的相关研究主要集中在镉胁迫对其种子萌发和幼苗生长的影响上，对甜玉米耐镉响应特点及其遗传机制的解析还相对较少。为此，本研究选取13份甜玉米骨干自交系在苗期进行镉胁迫处理，比较分析不同自交系在镉胁迫处理前后的表型差异，利用全基因组标记初步确定可能与甜玉米耐镉响应相关的分子标记，以期为甜玉米耐镉品种选育、分子标记辅助选择育种等提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用的13份甜玉米自交系材料均由某研究所收集、选育，包括T96-2、KY188、M55、M114A、T52-1、T96-4、M3、T43、T8-1、T35、M103、M118、M119。自交系间农艺性状和亲缘关系差异相对较大。

1.2 镉离子胁迫处理

甜玉米自交系种子用蒸馏水浸泡4 h后置于吸水纸上进行萌发，温度为28 ℃，无光照。挑选萌发后长势一致的种子播种于培养盒(长170 mm、宽117 mm、高68 mm)内，每盒12颗。采用沙培方式，在光照培养箱中使其生长，温度为28 ℃，相对湿度为60%，每日光照16 h。当甜玉米幼苗长至两叶一心期时进行镉(CdCl·2.5 HO)胁迫处理(T)，处理浓度为0.01 mol·L(40 mL)，处理时间为3 d。试验设置3个重复，每个重复幼苗数不少于10株，以等量蒸馏水处理作为对照(CK)。

1.3 表型观察与测定

从镉胁迫处理(记为0 d)开始，每隔1 d观察1次甜玉米幼苗生长状况，并采用SPAD-502型叶绿素测定仪(Konica Minolta，日本)测定幼苗第1片叶的叶绿素相对含量(SPAD值)，平行测定3次，取平均值。同时，在镉胁迫处理3 d后，小心地将幼苗从沙中取出，用清水清洗干净后进行表型鉴定和处理前后的对比分析。测定的表型性状主要包括苗高(PH)、根长(RL)、总根数(RN)、地上部鲜重/干重(SFW/SDW)、地下部鲜重/干重(RFW/RDW)。以中胚轴至幼苗最高叶片叶尖的长度作为苗高，中胚轴至主根根尖的长度作为根长。将基部以下的部分剪下作为地下部，其余部分作为地上部，吸干水分后测定鲜重，烘干(至质量恒定)后测定干重。

1.4 耐镉性综合评价分析

本试验综合采用隶属函数值法、主成分分析法对各甜玉米自交系的耐镉性进行综合评价，分析过程简述如下。

(1)基于甜玉米自交系在镉胁迫处理和对照下同一指标测定值的比，计算不同自交系各性状的耐镉指数(%)。为简便计，将各性状的耐镉指数记为相对性状，如苗高(PH)的耐镉指数就被记为相对苗高(RPH)，其他依此类推。最终，共获得相对苗高(RPH)、相对根长(RRL)、相对总根数(RRN)、相对地上部鲜重(RSFW)、相对地下部鲜重(RRFW)、相对地上部干重(RSDW)、相对地下部干重(RRDW)、相对鲜重根叶比(RSFW/RRFW)、相对干重根叶比(RSDW/RRDW)、相对总干重(RTDW)、相对总鲜重(RTFW)。

(2)基于不同甜玉米自交系的相对性状进行主成分分析，将其转换成若干个相对独立的综合评价指标(CI)，并将各个综合评价指标的贡献率作为其权重。

(3)计算不同甜玉米自交系对应于各综合评价指标的值，然后利用隶属函数值法获得不同甜玉米自交系在各综合评价指标下的隶属函数值()。

(4)将各甜玉米自交系在各综合评价指标下的隶属函数值与该综合评价指标权重的乘积加和，得到各甜玉米自交系的综合耐镉能力()。

1.5 DNA提取与遗传多态性分析

采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取13份甜玉米自交系幼苗叶片的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计法对所提取的DNA进行纯度和浓度检测。稀释DNA原液至质量浓度为30 ng·μL，-20 ℃保存备用。

选取玉米参考基因组中均匀分布的200个简单重复序列(SSR)分子标记(平均每条染色体上有20个多态性标记)，分别对13份甜玉米自交系进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，34个循环；72 ℃延伸5 min；20 ℃延伸1 min。参照顾丹丹等采用的方法，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染、显色和遗传多态性分析。将13份自交系的基因型与镉胁迫表型进行单标记分析，确定与甜玉米苗期镉胁迫响应相关的分子标记。

1.6 数据处理

利用Microsoft Excel 2010软件对镉胁迫处理前、后的表型数据进行统计分析。利用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)、单标记分析(single marker analysis)、主成分分析(principal component analysis)和隶属函数值(membership function value)分析。用Origin 8.0软件制图。

2 结果与分析

2.1 甜玉米自交系苗期耐镉能力差异

对13份甜玉米自交系幼苗镉胁迫处理前、后的表型数据进行分析，发现各表型性状间均存在一定的相关性(表1)。相对苗高与除相对地下部干重、相对鲜重根叶比和相对干重根叶比外的其他指标呈极显著(<0.01)相关性；相对地上部鲜重和相对地下部鲜重与除相对地下部干重、相对根长、相对鲜重根叶比和相对干重根叶比外的其他指标呈极显著(<0.01)相关性；除相对地下部干重和相对干重根叶比外，相对地上部干重与其他指标均呈极显著(<0.01)相关性；相对根数与除相对地下部干重和相对干重根叶比外的其他指标呈显著(<0.05)或极显著(<0.01)相关性；相对地下部干重与相对干重根叶比、相对总干重呈极显著(<0.01)正相关；相对根长与相对苗高、相对总根数，相对地上部干重、相对鲜重根叶比、相对总鲜重呈显著(<0.05)或极显著(<0.01)相关性；相对总干重与除相对根长、相对鲜重根叶比外的其他指标呈显著(<0.05)或极显著(<0.01)相关性；相对总鲜重与除相对地下部干重、相对鲜重根叶比和相对干重根叶比外的其他指标呈显著(<0.05)或极显著(<0.01)相关性。

可见，各指标的相关性信息存在一定的交叉重叠，这在一定程度上会影响对玉米自交系耐镉能力的鉴定与筛选。为此，首先，采用主成分分析法将上述11个相互关联的指标转换为新的相互独立的综合指标，以弥补单一指标评价耐镉性的局限。结果表明，前3个综合评价指标(CI～CI)的贡献率分别为44.14%、26.26%、10.12%，累计达到80.52%，可代表11个单项指标的大部分信息。然后，基于各自交系在这3个综合指标上值的隶属函数值(～)和相应综合评价指标的权重来评价不同自交系的综合耐镉能力()，根据值大小进行排序，并采用最大距离法对值进行聚类分析。在13个甜玉米自交系中：KY188、M114A不耐镉，为敏感型自交系；T96-4、M3、T35和T8-1高度耐镉，为耐受型自交系；其余5个中度耐镉，为中间型材料(表2、图1)。

2.2 镉胁迫对不同镉耐性甜玉米自交系幼苗生理性状的影响

为了进一步探究甜玉米自交系对镉胁迫响应的差异特点，对这些自交系进行表型鉴定与分析。结果显示，与对照相比，2个敏感型自交系KY188和M114A在镉胁迫处理后2～3 d内第一片叶开始出现明显的黄化，随着时间延长，叶片逐渐枯萎；而T96-4、M3、T8-1和T35等4个耐受型自交系的叶片生长较为正常，叶片颜色变化不明显(图2)。镉胁迫处理1 d，敏感型自交系KY188叶片的SPAD值明显降低，而对照处理下和耐受型材料都无显著变化。随着处理时间延长，敏感型自交系KY188叶片的SPAD值显著(<0.05)降低，几近为0，与处理后叶片黄化的现象一致；而耐受型自交系T96-4的SPAD值相较于对照处理始终无显著差异。

为了分析镉胁迫对甜玉米幼苗生物量积累的影响，分别测定镉胁迫处理前、后甜玉米幼苗地上部和地下部的鲜重和干重(图3)。与对照相比：镉处理后耐受型自交系T96-4的地上部、地下部鲜重与干重均无显著变化；而敏感型自交系KY188的地上部鲜重和干重分别显著(<0.05)降低了58.86%和2.04%，地下部鲜重与干重分别显著(<0.05)降低了33.77%与26.11%，总鲜重与总干重分别显著(<0.05)降低了47.11%与14.29%。由此可见，敏感型甜玉米自交系幼苗在镉胁迫下，生长发育受到严重抑制，生物量积累减少；而耐受型甜玉米自交系幼苗在生物量积累上受到的影响较小。

表1 镉胁迫下甜玉米自交系不同指标的相关系数矩阵

表2 不同甜玉米自交系的耐镉性

图1 不同甜玉米自交系耐镉性的聚类分析结果Fig.1 Cluster analysis result of cadmium tolerance of different sweet corn inbred lines

CK，对照；T，镉胁迫。下同。CK, Control; T, Cd stress.The same as below.图2 镉胁迫处理对甜玉米自交系幼苗生长情况(A)和SPAD值(B)的影响Fig.2 Effect of cadmium stress on growth (A) and SPAD value (B) of different sweet corn inbred lines

“*”和“**”分别表示差异显著(P<0.05)与极显著(P<0.01)。“*” and “**” indicated significant difference at P<0.05 and P<0.01， respectively.图3 镉胁迫处理对不同甜玉米自交系幼苗生物量的影响Fig.3 Effect of cadmium treatment on seedling biomass of different sweet corn inbred lines

为了进一步分析镉胁迫处理下不同甜玉米自交系生物量积累差异的原因，分别测定甜玉米的苗高、根长、总根数等指标。结果显示，对于敏感型自交系KY188来说，与对照相比，镉胁迫处理下，玉米幼苗的生长受到抑制，苗高显著(<0.05)降低了18.87%，总根数显著(<0.05)降低了24.32%，根长显著(<0.05)降低了21.13%(表3)。相比之下，耐受型自交系T96-4的上述指标并无显著变化。这说明，镉胁迫不仅抑制敏感型甜玉米自交系幼苗地上部的生长，也会影响其根系发育，从而影响其生物量积累，最终导致甜玉米幼苗生长发育异常。

2.3 与甜玉米苗期耐镉性状相关的SSR标记分析

为了进一步分析不同甜玉米自交系对镉胁迫响应差异的遗传调控机制，利用玉米全基因组SSR遗传标记分别对所选自交系进行筛选，通过单标记分析的方法共检测到9个与耐镉性状相关的SSR位点，分别是bnlg108、bnlg1456、bnlg589、bnlg2305、umc1083、umc1139、umc1170、bnlg210、phi059(表4)。在上述9个位点上，可能存在甜玉米幼苗响应镉胁迫的关键基因。其中，bnlg108、bnlg2305、umc1083、umc1139、umc1170、bnlg210和phi059等标记达到极显著(<0.01)水平，它们分别位于玉米的第2、5、6、8、9、10号染色体上。上述研究结果可为后续甜玉米耐镉性状相关基因的图位克隆和遗传改良提供一定的遗传依据。

表3 镉处理对不同甜玉米自交系苗高、总根数、根长的影响

表4 甜玉米自交系中与其苗期耐镉性状相关的遗传标记

3 讨论

土壤Cd污染是我国乃至全球性的环境问题。玉米对Cd具有较强的吸收积累能力。我国南方酸性土壤中积累了过多的镉等重金属离子，会限制作物生长及其生产过程。本研究对13份甜玉米自交系幼苗进行镉胁迫处理，分析和鉴定其镉耐受性。结果显示，在相同镉浓度胁迫条件下，不同基因型的甜玉米自交系受到的影响不同。通过比较分析镉胁迫处理前后不同自交系苗高、根长、生物量等指标的变化，确定自交系T96-4、M3、T35和T8-1对镉胁迫的耐受能力强，而KY188和M114A对镉胁迫不耐受，为敏感型，其余5份表现为中度耐镉。王艳芳等对6种类型的玉米进行镉胁迫处理，发现普通玉米的耐受性要高于甜玉米，甜玉米的耐受性高于糯玉米，普通玉米郑单-958对镉的生物富集和转运能力最小，耐受性最强。张珂等发现，小麦和玉米幼苗的生长均受镉胁迫的显著抑制，且玉米受到镉胁迫的抑制作用更强。

镉对作物生长发育和生理变化的影响是复杂多样的。为此，研究人员不断探寻适宜评价作物耐镉能力的指标。顾丹丹等将植株地上部干重和叶片SPAD值作为玉米幼苗耐镉品种的筛选指标；于子昊等发现，不同品种玉米的生物量、根系形态、根鞘性状和植株Cd累积特征均存在显著差异。Lapie等通过测定根系分泌物中的代谢产物，鉴定玉米镉胁迫响应特点。刘丽珍等把苗高、生物量和抗氧化酶活性变化作为评价玉米幼苗耐镉性的指标。单长卷等发现，茉莉酸可提高玉米幼苗叶片的抗氧化能力和光合色素含量，从而增加生物量积累，缓解镉胁迫伤害。可见，很难确定统一的标准来评价玉米的耐镉能力。本研究测定了玉米幼苗11个性状对镉胁迫的响应，但这些指标间存在较强的相关性。为此，引入主成分分析的方法，将11个性状指标转换为3个新的独立的综合指标，综合评价甜玉米自交系的耐镉性。

镉胁迫下，植物的多种生理指标均会受到抑制，其中，生物量能够直接反映植物在镉胁迫下的耐受差异。王艳芳等和李国良均发现，低浓度镉胁迫会促进种子的萌发和幼苗生长，而高浓度的镉胁迫则会显著抑制植物生长。研究表明，生物量积累的减少可能与镉胁迫下植物叶绿体亚显微结构受到破坏，以及叶绿素a、叶绿素b含量和电子传递效率降低有关。本研究中，与对照相比，敏感型自交系在镉胁迫下叶片中的叶绿素相对含量(SPAD值)明显降低，叶片黄化，最终导致生物量积累减少；而耐受型自交系无论是叶绿素相对含量还是生物量积累都没有显著变化。

现有的关于甜玉米苗期镉胁迫的研究多集中在表型评价和生理生化分析上，很少有对基因型和遗传调控位点的解析。本研究利用玉米全基因组200个SSR标记和13份自交系的综合耐镉表型进行单标记分析，发现9个与甜玉米苗期耐镉能力显著相关的位点，其中7个达到极显著水平。但是，甜玉米对镉胁迫的响应过程和遗传机理是一个复杂的过程，受到多个位点的共同调控。因此，今后应继续构建更大的自然群体或分离群体开展关联分析和基因克隆，从而深入挖掘与甜玉米耐镉性状相关的基因，解析甜玉米镉胁迫响应机制。