不同封醅时间对镇江香醋品质的影响

李 信，陈 雯，熊 锋，张俊红，杨乐云，朱 杰，陆荣松，陆 平，赵顺华，崔鹏景

（江苏恒顺醋业股份有限公司，江苏镇江 212000）

食醋在我国具有悠久的历史，是生活中不可或缺的酸性调味品，其酿造原料以谷物为主。食醋由于酿造工艺的不同，又可以将其分为欧美国家采用的液态深层发酵和亚洲地区采用的固态发酵两种工艺。镇江香醋是我国四大名醋之一，属于典型的传统固态发酵工艺调味品。镇江香醋因其具有“酸而不涩，香而微甜，色浓味鲜”的特点，深受消费者喜爱，更是驰名于海内外。“恒顺镇江香醋酿制技艺”也已被列入首批国家级非物质文化遗产名录，是我国的酿造国宝，其酿造工艺要求复杂，需以精选优质江南糯米为主要原料，先后经过酒精发酵、醋酸发酵、封醅和煎煮等40 多道工序，其主要的酿造工艺流程如图1 所示。

图1 镇江香醋固态酿造工艺流程图Fig.1 The production flow chart of Zhenjiang vinegar solid state fermentation

镇江香醋也因其工艺的复杂性和特殊性，导致其品质受到较多因素的影响。目前已有较多研究针对酒精发酵、大米原料、醋酸发酵、米色添加、陈酿等环节进行了探究，表明这些因素会影响香醋中的微生物菌落组成及其活性、挥发性风味物质种类及含量，从而影响到香醋的品质。封醅工艺则是镇江香醋酿造过程中所采用的一种特色工艺，指的是在醋酸发酵结束后将醋醅压实，用塑料薄膜盖实，四周用食盐封实，隔绝空气的过程。其目的是通过厌氧处理杀死醋酸菌等微生物，从而避免醋醅的过氧化，才能赋予其独特的风味和功能。Xu等通过对发酵结束后的醋醅和封醅后的醋醅进行基础理化指标检测，发现醅酸从13.41 g/100 g 上升至17.31 g/100 g，乳酸、乙酸、琥珀酸和柠檬酸也有上升。

目前，对镇江香醋的研究主要集中在醋酸发酵和陈酿阶段，但封醅阶段通过盐封营造了一个厌氧环境，对醋醅的风味物质变化起到重要的作用，通过对封醅工艺进行深入研究，将对镇江香醋品质的提升具有重要的指导意义。目前仅较少研究对封醅前后的醋卤指标进行了分析，但未对不同封醅时间香醋品质进行整体研究，因此，本文将分析不同封醅时间香醋的基础理化指标、有机酸、氨基酸、挥发性物质等指标的差异，探究封醅时间对镇江香醋品质的影响，为镇江香醋生产中的过程控制和产品品质提升提供更多参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糯米 镇江恒顺米业有限公司提供，产地江苏镇江；酒药、麦曲、麦麸、大糠、种子醅 江苏恒顺醋业股份有限公司提供；酒石酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸、焦谷氨酸、2-辛醇、4-甲基-2-戊醇色谱纯，Sigma 公司；氨基酸混合标准液（35 种）北京捷盛依科科技发展有限公司；乙醛、苯乙醛、异戊醛、异丁醛、2，3-丁二醇、棕榈酸乙酯、十五酸乙酯、辛酸乙酯、-壬内酯、2，4-二叔丁基苯酚、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚 色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；异戊醇、异丁醇、正己醇、苯乙醇、正辛醇、丁二酸二乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、正己酸乙酯、苯甲醛、丁酸、辛酸、壬酸 色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；磺基水杨酸 国药集团化学试剂有限公司。

LC1260 型高相液相色谱仪、US1541L442 气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头 美国思必可公司；S-433D 氨基酸分析仪 德国塞卡姆公司；88880018 漩涡混合仪赛默飞世尔（中国）有限公司；BSA822 电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FE28 精密pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；5424R 高速冷冻离心机 德国艾本德公司。

1.2 实验方法

1.2.1 镇江香醋醋醅的发酵 酒精发酵：将糯米浸水24 h 后沥干蒸煮，待蒸熟的糯米冷却至35 ℃时加入0.3%（w/w）酒药搅拌均匀，常温下发酵至第3 d加入1%（w/w）麦曲和适量水进行搅拌，发酵至第7 d形成酒醪。

醋醅发酵：将酒醪、麦麸、大糠放入大缸中搅拌均匀形成醋醅，取种子醅放于拌好的醋醅上，用大糠覆盖。从第2 d 开始，逐层将上层发热的醋醅与下一层未发热的醋醅充分拌匀，一般10 d 可将醋醅翻至露底，露底后每日对醋醅进行露底翻醅，直至第21 d发酵结束形成成熟醋醅。

1.2.2 不同封醅时间镇江香醋的制作 镇江香醋醋醅发酵成熟时：设计5 组封醅池，将成熟醋醅分别封醅0、3、7、15、30 d，每组平行三次，封醅结束后即进行淋醋操作。

1.2.3 基本理化指标测定 封醅结束后，从醋醅中取出醋卤，经8000 r/min 离心10 min 后，取上清液使用。总酸和不挥发酸参照《GB 18187 -2000》方法进行测定，氨基酸态氮参照《GB 18186-2000》方法进行测定，还原糖参照《GB5009.7-2016》中直接滴定法进行测定。

1.2.4 有机酸测定 采用高效液相色谱测定，参照《GB/T 18623-2011》方法，以保留时间和样品加标定性，采用峰面积外标法定量。

1.2.5 游离氨基酸测定 采用全自动氨基酸分析仪测定，前期处理：取1 mL 样品，加入9 倍体积的1%磺基水杨酸，10000 r/min 离心15 min，取上清液用0.22 μm 膜过滤后供上机测定使用，进样体积为50 μL；检测波长为570、440 nm；茚三酮流速为0.25 mL/min，流动相流速为0.45 mL/min；反应器温度为 130 ℃，具体条件见参照文献[21]；以标品保留时间定性，采用峰面积外标法定量。

1.2.6 挥发性风味物质测定 采用顶空固相微萃取-气质联用测定，样品处理：将5 mL 醋样置于10 mL样品瓶中加入1.5 g 固体氯化钠，50 ℃条件下用SPME 萃取头顶空吸附40 min，搅拌转速250 r/min；色谱条件：DB-1701 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气He，流量1 mL/min，不分流，进样口温度250 ℃。柱温起始32 ℃，以3 ℃/min 升温至120 ℃，再以10 ℃/min 升温至250 ℃，保持10 min；质谱条件：接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，电离方式EI，电子能量70 eV，扫描质量范围33～450 u，后续操作参照文献[22]；定性分析：通过对挥发性成分采用质谱（谱库检索）方法和对应标准品保留指数对比进行鉴定；定量分析：以4-甲基-2-戊醇作为内标进行内标法定量。

1.3 数据处理

实验采用SPSS17.0 软件进行数据分析，＜0.05表示影响显著，实验数据为三次平行实验的均值。

2 结果与分析

2.1 不同封醅时间对底部醋卤基本理化指标的影响

封醅后醋卤的基本理化指标是反映成品醋产量和品质的重要指标之一。因此，本研究对不同封醅时间醋卤的主要理化指标总酸、还原糖、不挥发酸和氨基酸态氮进行了测定，结果如表1 所示。

从表1 可以看出，封醅后醋卤的总酸和不挥发酸随着封醅时间的增加而增加，封醅至30 d 时总酸与不挥发酸分别达到最高值7.35±0.05 g/100 mL 和2.39±0.01 g/100 mL，与不封醅相比较有显著性增加（＜0.05），但封醅15 d 与封醅30 d 总酸和不挥发酸无显著性（＞0.05）增加。通过封醅处理，还原糖含量则显著性降低（＜0.05），这主要是因为封醅阶段的厌氧环境较适宜耐酸性的乳酸菌生长，乳酸菌在厌氧环境中消耗部分还原糖生成乳酸和其他风味物质。氨基酸态氮在整个封醅阶段无显著性变化（＞0.05），这可能由于在醋酸发酵阶段蛋白质已较充分利用，因而在封醅阶段没有明显变化。因此，通过对封醅处理15 d 以上醋醅的总酸、还原糖、不挥发酸、氨基酸态氮等指标分析，表明封醅有助于总酸和不挥发酸含量的提高，丰富香醋的风味。

表1 不同封醅时间对醋卤的基本理化指标的影响Table 1 Effect of different dumping process on the physicochemical index of vinegar liquid

2.2 不同封醅时间对底部醋卤的有机酸含量的影响

粮食发酵食醋中富含多种有机酸，其结构组成和含量会影响产品的风味特色，是衡量酿造食醋品质的重要指标之一。镇江香醋的有机酸种类丰富，其中乙酸、乳酸、焦谷氨酸、琥珀酸和柠檬酸等是影响镇江香醋口感的重要有机酸。因此，本研究对不同封醅时间底部醋卤有机酸进行了检测分析，其结果如表2 所示。

由表2 可知，在不同封醅天数的醋卤中共检测出8 种有机酸，含量从高到低依次为乙酸、乳酸、酒石酸、焦谷氨酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酮酸、酮戊二酸。醋卤中含量最高有机酸为乙酸5044.14±1.32 mg/100 mL（不封醅），其次是乳酸达到1135.87±1.07 mg/100 mL（封醅30 d），这与镇江香醋酿造过程的核心功能微生物醋酸菌和乳酸菌有关。通过封醅工艺处理，乙酸含量没有显著性变化（＞0.05），乙酸可与醇等物质生成乙酸乙酯等其他风味物质。乳酸含量从1105.78±0.76 mg/100 mL（不封醅）增长至1135.87±1.07 mg/100 mL（封醅30 d），这是由于封醅阶段创造的厌氧环境，使得乳酸菌继续其代谢生成乳酸，与许伟对封醅醅酸检测结果相似。其余含量较高的有机酸为酒石酸、焦谷氨酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酮酸和酮戊二酸，可为镇江香醋提供酸、咸、苦等复合风味，其含量在封醅阶段没有显著性变化（＞0.05）。食醋中又可将有机酸分为挥发性酸（乙酸）和不挥发性酸（乳酸、酒石酸、焦谷氨酸、琥珀酸等），不挥发性酸越高，更加能够赋予食醋轻柔的口感。因此，通过7 d以上封醅处理后，在有机酸中乳酸含量显著性增加（＜0.05），有利于香醋柔和感的提高。

表2 不同封醅时间对醋卤中有机酸含量的影响Table 2 Effect of different dumping process on the content of organic acid of vinegar liquid

2.3 不同封醅时间对底部醋卤的氨基酸含量的影响

氨基酸作为镇江香醋重要的呈味物质，使得香醋富含营养，味道醇厚柔和，是镇江香醋重要的风味成分之一。因此，本研究对不同封醅天数的醋卤的多种氨基酸进行了测定，其结果如表3 所示。

由表3 可知，在封醅后的醋卤中共检测到24 种不同的氨基酸，氨基酸总量从不封醅的11066.05±0.88 mg/L 显著增长（＜0.05）至封醅后的11167.21±0.20 mg/L（封醅30 d），提高了101.16 mg/L。从游离氨基酸种类及其含量上来看，封醅后的醋卤中含量较高的6 种氨基酸与未封醅醋卤的相同，分别为亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸，含量均达到700 mg/L 以上。余宁华通过对我国固态酿造食醋进行氨基酸分析，得出3 种特征性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸，本研究测出亮氨酸和丙氨酸在醋卤中的含量都达到了1315 mg/L 以上。通过表3 的数据分析，整个封醅阶段游离氨基酸的种类均为24 种，但随着封醅时间增长游离氨基酸总量增多。与未封醅组相比，封醅3 d 天冬氨酸、羟脯氨酸、脯氨酸分别显著（＜0.05）增长至1051.23±0.19、6.52±0.12、189.95±0.13 mg/L；封醅7 d 缬氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸分别显著（＜0.05）增长至210.50±0.44、103.50±0.51、365.85±0.03、653.21±0.14、521.58±0.14、506.21±0.06、715.29±0.02、625.98±0.08 mg/L；封醅15 d 异亮氨酸、-氨基丁酸、鸟氨酸分别显著（＜0.05）增长至654.01±0.02、16.86±0.56、102.98±0.07 mg/L。经过15 d 以上的封醅处理，醋卤中18 种氨基酸的含量均显著增加（＜0.05），可为香醋后期陈酿提供更多的风味基础物质。

表3 不同封醅时间对醋卤中游离氨基酸含量的影响Table 3 Effect of different dumping process on the content of free amino acid in vinegar liquid

2.4 不同封醅时间对香醋中挥发性物质含量的影响

镇江香醋的灵魂就在于香气，即挥发性风味物质，可直接影响消费者对食醋的感官。镇江香醋含有的挥发性物质种类多样且复杂。因此，本研究对不同封醅时间的香醋成品中挥发性风味物质进行了定量分析。

2.4.1 封醅过程中香醋挥发性物质变化 不同封醅时间处理的香醋挥发性物质变化结果如表4 所示，不同类别挥发性物质种类及含量变化如图2 所示。

表4 不同封醅时间对香醋中挥发性风味物质含量的影响Table 4 Effect of different dumping process on the content of volatile flavor substance in vinegar

续表 4

从表4 中可以看出，酸类、醇类、酯类、醛类、酮类、吡嗪类和其他杂环化合物的组合，形成了镇江香醋特有的香气。不同封醅时间制备的成品香醋中挥发性风味物质具有较明显的差异。在不封醅的香醋中，共检出47 种挥发性风味物质，总含量为36.966 mg/L。不同封醅时间后的香醋中，共检出58～63 种挥发性风味物质，总含量为37.415～39.390 mg/L，其中封醅15 d 后香气物质种类达到63 种，总含量达到最高值39.390 mg/L。通过封醅处理，挥发性物质在种类和含量上均有所增加。

2.4.1.1 酸类 酸类物质是食醋酸味的主要呈味物质，从表4 中可以看出，主要酸类物质为异戊酸和己酸。图2（a）结果表示随着封醅时间的加长，酸类物质种类在封醅3 d 增至11 种，封醅15 d 则降低至9种，封醅30 d 降低至8 种；酸类物质总含量随着时间加长而不断降低，封醅30 d 降低至2.990±0.071 mg/L，这可能是由于经过封醅处理，大量的好氧菌死亡，导致酸类物质种类和数量的下降。因此，封醅处理15 d后会降低醋中挥发性酸类物质种类及含量。

2.4.1.2 醇类 在食醋酿造过程中，乙醇、苯乙醇是镇江香醋醋酸发酵的主要底物，从表4 中可以看出封醅30 d 后乙醇、苯乙醇含量分别为2.040±0.291、14.622±0.708 mg/L，处于下降趋势，乙醇主要由酿酒酵母发酵产生，苯乙醇是苯丙氨酸在酵母菌降解产生醛后进一步还原生产。图2（b）结果表示未封醅醋卤中检测出醇类物质有10 种，总含量为23.505±0.812 mg/L，经过封醅处理15 d 后以后，醇类种类下降至7 种，总含量降为20.382 mg/L，而且异丁醇、正己醇、正辛醇没有检测出，究其原因，可能是因为参与酯化反应和氧化反应造成消耗。通过封醅处理15 d 以上，醇类种类和含量均产生下降，有助于酯类物质的生产。

2.4.1.3 酯类 酯类物质是镇江香醋香味的主要物质也是挥发性成分中最多的一类物质。从图2（c）中可以看出，在不封醅的香醋中仅检出10 种，而封醅3 d 后的香醋中检出15 种，且含量增高，其中封醅30 d 后总含量达到最高值6.779±0.118 mg/L，种类达到20 种。通过封醅处理，与未封醅组相比新增了乙酸甲酯、乙酸丁酯、苯乙酸乙酯、甲酸-2-苯乙酯、DL-2-羟基-4-甲基戊酯、十五酸乙酯、反油酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、香草酸乙酯、4-羟基-3-甲氧基-苯丙酸乙酯10 种酯类物质。从表4 结果得知，乙酸乙酯从未封醅的0.850±0.035 mg/L 增长至封醅30 d的1.380±0.067 mg/L；乙酸苯乙酯从未封醅的0.025±0.004 mg/L 增长至封醅30 d 的1.423±0.008 mg/L，这与醇类物质中乙醇和苯乙醇含量降低相对应，醇与酸反应形成了酯。通过酯类指标的变化分析，封醅处理有助于酯类物质种类和含量的增加，封醅时间越长，酯类物质总含量越高，香醋成品的风味可能越好。

图2 镇江香醋封醅过程中酸类（a）、醇类（b）、酯类（c）、醛类（d）、酮类（e）、吡嗪类（f）和其他类（g）物质种类及含量变化Fig.2 Changes of types and contents of acids (a), alcohols (b), esters (c), aldehydes (d), ketones (e), pyrazines (f) and other kinds (g)during the dumping peocess of Zhenjiang vinegar

2.4.1.4 醛类 图2（d）中表明封醅15 d 后的香醋中醛类物质种类比封醅前多2 种，但正几醛则随着封醅处理后未检出，醛类总含量由5.590±0.345 mg/L增长至5.826±0.317 mg/L。从表4 可以看出镇江香醋中的醛类物质主要为糠醛、苯甲醛、异戊醛、苯乙醛，其中糠醛含量最多，在封醅30 d 时为4.023±0.249 mg/L，镇江香醋含糖分较多，糖类和含氮化合物发生美拉德反应易生产糠醛。封醅处理可以提高香醋中醛类物质种类及含量。

2.4.1.5 酮类 从图2（e）中可以看出封醅15 d 后的香醋中酮类物质比封醅前多4 种，含量也从0.857±0.028 mg/L 增长至1.686±0.057 mg/L。经过封醅处理30 d 后3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二酮分别达到最高值0.923±0.053、0.688±0.024 mg/L，这两种物质对镇江香醋的特征风味作用突出且含量随着封醅天数的增加而增加，3-羟基-2-丁酮可由乳酸脱氢酶作用乳酸变为丙酮酸，丙酮酸继续酶化生成，封醅环节为乳酸菌代谢提供了条件从而使得3-羟基-2-丁酮含量增加；2,3-丁二酮通常被认为是四甲基吡嗪的前体物质。封醅处理15 d 后可使香醋中的酮类种类达到最高值7 种，总含量也增长至1.686±0.057 mg/L，封醅处理可以提高香醋中酮类物质种类及含量。

2.4.1.6 吡嗪类 图2（f）表明吡嗪类物质种类通过封醅处理从3 种变为5 种（封醅3 d 以上），表4 表明封醅时间越长吡嗪类总含量越高，从未封醅的0.763±0.021 mg/L 持续增长至封醅30 d 后的2.249±0.081 mg/L，是未封醅组的2.9 倍。主要的吡嗪类物质为四甲基吡嗪，四甲基吡嗪具有强烈的坚果和花生味，也是贡献镇江香醋风味的重要物质之一。通过对吡嗪类的指标分析，封醅处理3 d 后吡嗪类种类达到5 种，吡嗪类物质总含量也随着封醅时间延长而增加，封醅处理丰富了吡嗪类物质种类及总含量，可对香醋品质产生影响。

2.4.1.7 其他类 图2（g）表明其他类物质种类通过封醅处理从2 种增加至5 种，新增的种类为对乙基苯酚、2-乙酰吡咯、二甲基硫醚，封醅30 d 后其他类物质总含量由0.154±0.006 mg/L 增加至最高值0.428±0.014 mg/L，主要成分为4-甲氧基-2-甲氧基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚。通过其他类指标的变化分析，封醅处理有助于其他类物质种类和含量的增加，香醋成品的风味可能越好。

2.4.2 不同封醅时间镇江香醋挥发性物质主成分分析 采用SIMC 14.1 软件对不同封醅时间镇江香醋GC-MS 数据进行主成分分析，结果如图3 所示：在主成分为2 时，X 为0.95，为0.852（大于0.5），表明该模型的预测能力良好，所建模型稳定可靠。5 种不同封醅天数的样品在主成分空间中相对独立分布，得到明显区分，说明不同封醅时间的镇江香醋挥发性物质种类和含量存在差异。酸类和醇类的位置与不封醅镇江香醋的位置相近，说明酸类和醇类是不封醅香醋主要挥发性物质；酯类、酮类和其他物质位置与封醅15 d 和封醅30 d 镇江香醋位置相近，说明酯类、酮类等其他物质是封醅香醋的主要挥发性物质，品质更好。因此，封醅处理15 d 以上时对香醋成品中挥发性风味物质的形成具有较大的影响，封醅后的香醋成品中酯类、酮类、醛类等挥发性风味物质种类更多丰富，含量更高，风味更加浓郁。

图3 不同封醅时间镇江香醋挥发性物质PCA 分析双标图Fig.3 PCA biplot of volatile flavor substance in Zhenjiang vinegar during different dumping peocess

3 结论

与不封醅工艺相比较，镇江香醋通过封醅15 d后总酸和不挥发酸分别显著（＜0.05）增加至7.30±0.06 g/100 mL 和2.36±0.03 g/100 mL，还原糖显著（＜0.05）降低至2.25±0.02 g/100 mL，醋卤有机酸中乳酸含量显著性增加（＜0.05）至1133.57±1.47 mg/100 mL，这些指标的提高有助于香醋柔和度的提高；通过氨基酸分析得出经过15 d 以上的封醅处理，醋卤中18 种氨基酸的含量均显著增加（＜0.05），可为香醋后期陈酿提供更多的风味基础物质；通过对挥发性物质含量进行分析，得出封醅15 d 后香气物质种类达到最高的63 种，总含量也达到最高值39.390 mg/L，酯类和醇类是封醅香醋的主要挥发性物质。综合各项指标和风味物质差异，封醅工艺对香醋风味品质的形成有重要的影响，通过封醅处理15 d 以上的香醋品质优于不封醅的香醋，但其风味物质的差异形成的机理有待后续进一步地探究。