毒龙丹中马钱子炮制前后主要成分含量变化的UPLC法分析*

马 鹏，张远哲，黄宁川

(1 贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550000；2 贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳 550025)

中药马钱子源于马钱科植物马钱StrychnosnuxvornicaL．或云南马钱S.pierrianaA．W.Hill 的干燥成熟种子，始载于《本草纲目》，性温味苦，归肝、脾经，具有通络止痛、散结消肿的功效。马钱子主要有效成分为马钱子碱和士的宁，随着马钱子的药理研究的深入以及临床应用的推展[1]，马钱子的炮制研究日益得到重视。马钱子的传统炮制，有砂烫、油制、醋制、童便制、奶制等[2]，康世奇等[3]运用文献计量学对中药马钱子研究现状及发展趋势进行预测分析，提示“减毒增效”将是马钱子未来深入研究的重要方向。基于“减毒增效”的目的，以及近年来兴起的药物合制法，如桂枝、白术、苏木等制马钱子[4]，这些办法基本都属于单一辅料炮制。

毒龙丹是民国时期著名中医学家张觉人先生首创的马钱子炮制方法[5]，被称为“玄门四大丹”之一，毒龙丹主要是以马钱子为主要原料，配伍五石、五豆、童便、甘草等合制而成，可以称为马钱子多辅料炮制方法的代表性方法之一。经过合理配伍，临床上用于治疗内、外、妇、五官等科的病种可达 200余种。周学平等研究指出：以多种辅料的“异类相制”炮制法可以影响中药有毒物质成分的溶出，可以影响有毒物质内外源代谢通路，可以影响药物毒性成分结构变化，可以增强机体系统的保护能力等，是传统中药减毒配伍理论的主要内容，有着深刻的理论内涵，在中药配伍减毒中发挥了重要作用[6]。目前尚无文献报道毒龙丹的炮制方法与其他传统炮制方法的比较研究，故本实验利用UPLC色谱法检测毒龙丹中马钱子炮制前后的主要成分的变化，为丰富马钱子的炮制研究提供一定基础。

1 实 验

1.1 仪 器

Agilent 1290超高压高效液相色谱仪(DAD检测器),美国Agilent公司；OpenLab CDS色谱工作站；KQ-500E型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司；CPA225D 型十万分之一分析天平，德国赛多利斯公司。

1.2 试 药

乙腈(色谱纯)，美国TEDIA；其它试剂均为优级纯或分析纯；水为超纯水。对照品马钱子碱(批号MUST-21110417)、士的宁(批号MUST-21083011)，曼斯特生物科技有限公司，纯度均达到98%以上。马钱子样品购自成都荷花池药材市场，经贵州中医药大学第一附属医院罗君主任鉴定为马钱科植物马钱StrychnosnuxvornicaL.的干燥种子。丹砂、雄黄、曾青、白矾、磁石等五种矿物药材购自成都荷花池药材市场，白扁豆、赤豆、绿豆、黄豆、黑豆购自当地大型连锁超市。童便收集于健康学龄男性儿童，经卫生学检查符合标准。生甘草样品购自当地同仁堂药店。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(2.1mm×100 mm，1.8 μm)；流动相：乙腈(A)- 纯水(B)(0.2%的甲酸溶液)梯度洗脱， 0～5 min，10% A；6～10 min，10→20% A；10～20 min， 20→80% A；20～30 min，80% A。流速1.0 mL·min-1，检测波长260 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。在上述色谱条件下，马钱子碱、士的宁之间以及与其他组分之间分离度良好，马钱子碱、士的宁的理论塔板数均>5000。

图1 混合对照品(A)和毒龙丹样品(B)UPLC图

本文考察了乙腈-水、乙腈-水(0.2%甲酸溶液)，甲醇-水、甲醇-水(0.2%甲酸溶液)， 乙腈-水-三乙胺、甲醇-水-三乙胺等6种流动相系统，结果显示以乙腈-水(0.2%甲酸溶液)为流动相，进行梯度洗脱的分离度较好(R>1.5)，保留时间较好，峰形分离度较好。

2.2 毒龙丹的制备

制法：先将马钱子用童便、五石、五豆浸泡之，浸泡时间二十日。五石即丹砂、雄黄、曾青、白矾、磁石等，称五石散；五豆即扁豆、赤豆、绿豆、黄豆、黑豆等。浸泡过程中豆须发芽，但不可发得太长，以约3 cm许即行，扁豆的体积较大，发芽较迟，故必须早二、三日入浸，才能及时。五石则打如米粒大小。马钱子泡浸时，有几个阶段的变化，初时黄色，次呈暗红色，到暗红色时，即取出一粒视之，如中心变白色者，即为合度之证。此时即全部取出，逐粒刮去皮毛后，加入甘草水中，煮3 h，取出晒干，干后全部都呈黑色，碾成细末，备用。

本研究中毒龙丹基础辅料采用的五石、五豆分别具有“青、赤、黄、白、黑”五种颜色，蕴含中医五行生克制化意义；而甘草性味甘平，具有和调百药解毒的功效，童便性味咸寒，绿豆、赤豆有清热解毒利湿的功效，这些炮制辅料具有降解马钱子中一些毒性剧烈的成分的作用；而童便咸寒，可以滋阴降火，凉血散瘀，与五石中矿物质大多具有清心泻热、凉肝止痉等功效的药物一起，可以在临床使用过程中有效发挥多靶点拮抗马钱子对中枢神经系统、泌尿系统、免疫系统和心血管系统等毒性作用。

2.3 对照品溶液的制备

分别称取对照品马钱子碱5 mg、士的宁6 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解制成每1 mL含马钱子碱500 μg、士的宁600 μg的混合对照品储备溶液，于4 ℃冰箱中保存，备用。取混合对照品溶液储备液适量，用甲醇稀释5倍，即得马钱子碱、士的宁质量浓度分别为103.6、127.9 μg·mL-1的混合对照品溶液，备用。

2.4 供试品溶液的制备

称取干燥毒龙丹样品粉末(过5号筛)0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量。于25 ℃超声30 min，冷却，用甲醇补足失重，摇匀，静置60 min取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液即得。

本文为了考察了不同溶剂的提取效率，采用了单因素变量法进行考察，分别考察不同甲醇、乙醇、甲醇-水-盐酸溶液，不同的提取方法回流提取、索氏提取、超声提取、冷浸法，不同提取时间时间10、20、30、40、50, 60 min; 不同提取液体积10、20、25、30、40、50 mL对马钱子中马钱子及士的宁提取效率的影响。 结果表明： 马钱子及炮制品约0.5 g，用甲醇溶液，提取液体积25 mL，超声提取时间 30 min，提取率最高，且含量稳定，重复性好，故最终确定此方法提取。

2.5 线性关系考察

精密量取 “2.3”项下对照品溶液 1、2、4、6、8 mL分别稀释到 10 mL容量瓶中，定容。按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取 10 μL注入高效液相色谱仪进行分析，以各对照品峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，作标准曲线，得到回归方程，结果见表1所示。

表1 回归方程及线性范围

2.6 精密度试验

取同一混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录各成分的峰面积。结果马钱子碱、士的宁峰面积RSD分别为0.88%、0.56%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一毒龙丹样品，按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，记录各成分的峰面积。结果马钱子碱、士的宁峰面积RSD分别为1.03%、0.79%，表明本方法重现性良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样，记录各成分的峰面积。结果马钱子碱、士的宁峰面积RSD分别为1.18%、0.62%,表明供试品溶液于24 h内测定结果稳定。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的马钱子样品6份，每份1 g，分别精密添加与样品中含量相当的马钱子碱、士的宁对照品，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，计算各成分的平均加样回收率。经计算，马钱子的平均回收率为99.63%，RSD值为0.3%；士的宁的平均回收率为99.85%，RSD值为0.5%，表明本方法的回收率良好。

2.10 样品含量测定

取生马钱子、毒龙丹适量，精密称定，按“2.4”项下方法每批样品平行制备3份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录峰面积，根据线性方程计算马钱子碱、士的宁的含量，结果见表2所示。

从表2实验结果可以看出，采用毒龙丹的马钱子炮制方法后，马钱子中的马钱子碱和士的宁均得到明显的下降，从试验层面揭示了毒龙丹的临床使用安全的初步原因。

表2 含量测定结果(n=3)

3 结 论

本研究中毒龙丹中的马钱子炮制方法，从实验结果来看，的确可以使马钱子中马钱子碱和士的宁的含量得到大幅度的下降，从而保证了马钱子在临床实用的安全性及有效性。本实验从毒龙丹中马钱子炮制前后主要化学成分变化的角度，揭示了毒龙丹的炮制工艺具有一定的科学性和合理性。更深一层次研究比如药理及毒理方面的试验有待后续的深化与补充。