基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的半夏厚朴汤化学成分分析*

沈 璐, 冯 芳,2

(1 中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京 210009；2 药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京 210009)

半夏厚朴汤，出自《金匮要略》：“妇人咽中有如炙脔，半夏厚朴汤主之”，主治慢性咽炎、失眠、抑郁等。半夏厚朴汤全方由半夏、茯苓、厚朴、生姜、紫苏组成。目前关于单味药材的化学成分已有许多研究，但关于半夏厚朴汤全方化学成分鲜有报道，而中药的起效是一个多成分、多靶点的协同作用过程，因此有必要明确半夏厚朴汤的药效物质基础。本研究采用UPLC Q-Exactive Orbitrap-MS技术，对半夏厚朴汤进行全面分析，为进一步研究其药理活性和投入临床应用奠定基础。

1 仪器与试药

Vanquish Flex超高效液相色谱仪，美国Thermo公司；Q-Exactive Orbitrap质谱，美国Thermo公司；Xcalibur工作站，美国Thermo公司；AB135-S 型电子天平，梅特勒-托利多上海有限公司；高速多功能粉碎机，上海冰都电器有限公司；RE-52CS 型真空旋转蒸发仪，上海亚荣仪器厂；FD-1-SD 型真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；AnkeTGL-16B型台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂。

姜半夏(批号190901)，山东豪泰中药饮片有限公司；厚朴(批号294200502)，河北睿达药业有限公司；茯苓(批号201224001)，河北金草药业有限公司；紫苏叶(批号112201201)，河北睿达药业有限公司；生姜购买自当地菜市场。符合《中国药典》2020版一部有关规定。姜半夏、厚朴、茯苓粉碎，生姜切为小块，待用。

对照品6-姜辣素、厚朴酚、和厚朴酚、琥珀酸、腺苷、芹菜素、茯苓酸、阿魏酸均购自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇(色谱纯)，德国Merck公司；甲酸(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich公司；水，哇哈哈纯净水。

2 方 法

2.1 色谱条件

色谱柱XBridge BEH C18column (100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)，流动相0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～1.5 min,2%B;1.5～23 min,2～30%B;23～34 min,30～98%B;34～41 min, 98%B;41～41.1 min,98～2%B;41.1～45 min,2%B)，柱温40 ℃，流速0.3 mL / min，进样量5 μL。

2.2 质谱条件

采用HESI离子源，正、负离子扫描模式；喷雾电压正极3.5 kV，负极2.8 kV；毛细管温度350 ℃；鞘气和辅助气均为N2，鞘气流速45 Arb，辅助气流速10 Arb；扫描模式Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率60000，dd-MS2分辨率15000；碰撞能量20、40、60 eV；质谱采集范围m/z 100 ～1200 Da。

2.3 样品制备

2.3.1 对照品溶液的制备

精密称取各对照品加甲醇超声溶解配制成质量浓度约为 1 mg/mL的储备液，分别取储备液适量，配制成各质量浓度约为100 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3.2 冻干粉的制备

参照《金匮要略》记载，换算成现代剂量：姜半夏15 g，厚朴9 g，茯苓12 g，生姜15 g，紫苏叶6 g，加入相当于全方量10倍的水(570 mL)，浸泡0.5 h，然后煮沸1 h过滤，经过 6层纱布过滤；残留物第二次再加入相当于全方量8倍的水重新煮沸，合并两次提取物，冻干称重。按照相同的制备方法分别制备单味药材姜半夏冻干粉、厚朴冻干粉、茯苓冻干粉、生姜冻干粉和紫苏叶冻干粉。

2.3.3 供试品溶液的制备

称取适量的半夏厚朴汤和各单味药材冻干粉适量，分别加水配成生药浓度约为0.5 g/mL的半夏厚朴汤水溶液，0.1 g/mL的半夏水溶液，0.1 g/mL 的茯苓水溶液，0.1 g/mL的生姜水溶液，0.1 g/mL厚朴水溶液以及0.1 g/mL紫苏水溶液，分别加入一定量甲醇，使甲醇体积占比达到70%，4 ℃下静置 24 h，在16000 rpm离心机上离心10 min，取上清液，经0.22 μm滤膜滤过，取续滤液待用。

2.4 数据分析

查询国内外相关文献，收集组方中5味药材的化学成分信息，包括名称、分子式、精确分子量、准分子离子、碎片离子等信息，建立一个数据库。采用Xcalibur软件对Q-Exactive Orbitrap-MS总离子流图进行峰提取处理，然后比对自建库，对各分子离子峰代表的化学成分进行鉴定。

3 结 果

半夏厚朴汤在正负离子模式下的总离子流图(TIC)见图1所示。通过质谱的裂解规律共推测出了90种化学成分，见表1所示。

图1 半夏厚朴汤在正离子(A)和负离子(B)模式下的TIC图

表1 半夏厚朴汤化学成分

续表1

*与标准品比对；▲[M+H-H2O]+；★[M]+；B：半夏；H：厚朴；F：茯苓；S：生姜；Z：紫苏；All：都有。

以和厚朴酚在负离子条件下的裂解为例，化合物121在一级质谱中的准分子离子为m/z 265.1232[M-H]-,在二级质谱中，负离子模式下[M-H]-分别丢失一分子CH4、·C3H5和C3H6生成m/z 249.0925、m/z 224.0851和m/z 223.0781的碎片离子；m/z 249.0925的碎片离子继续丢失一分子C3H4生成m/z 209.0596的碎片离子；m/z 223.0781的碎片离子继续丢失一分子C2H2生成m/z 197.0605的碎片离子。通过与自建库的和厚朴酚对比，初步推断该化合物为和厚朴酚，通过与对照品的保留时间和碎片离子对比，进一步确证该化合物是和厚朴酚，其在负离子模式下的裂解途径见图2所示。

图2 和厚朴酚在负离子模式下可能的裂解途径

4 结 论

本研究采用UPLC Q-Exactive Orbitrap-MS技术，结合二级质谱数据、保留时间，与相关数据库和文献进行比对，共鉴别了半夏厚朴汤中90种化合物，主要包括苯丙素类、氨基酸类、黄酮类和三萜类成分。该方法快速、灵敏、准确度高，可作为半夏厚朴汤质量控制的参考方法之一，同时为半夏厚朴汤后续的临床应用奠定了物质基础。