青藤碱通过阻止NF-κB通路激活抑制IL-1β诱导的椎间盘终板软骨细胞炎症及退变

付美艳 杨镜以 温欣 田薇

(1乌鲁木齐市友谊医院中医科，新疆 乌鲁木齐 830049；2杭州海亮馨蕙馨医院中医科；3新疆医科大学公共卫生学院)

椎间盘退变是导致椎间盘退行性病变(IVDD)的病理基础改变，是导致颈部、下腰部疼痛及功能障碍的主要病因〔1〕。流行病学显示下腰部疼痛已成为全球致残的主要病因〔2〕。终板软骨作为椎间盘组织的重要组成部分，其可维持椎间盘形态，供应椎间盘营养，吸收和分离脊柱机械负荷的重要压力，防止髓核向邻近椎体突出〔2，3〕。终板软骨细胞的炎症及退变与IVDD呈显著相关性〔4〕。青藤碱是一种从药用植物青藤中提取出来的单体，既往研究显示青藤碱具有显著免疫调节、抗感染、抗肿瘤等作用〔5〕。郑洁等〔6〕指出青藤碱可以显著抑制家兔膝关节骨性关节炎模型中的滑膜炎症并延缓软骨退变。青藤碱对于椎间盘软骨细胞炎症及退变作用的相关研究较少，本研究旨在探讨青藤碱对于椎间盘软骨细胞炎症及退变的疗效并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂 采取7周龄雄性SD大鼠8只，体重(150±24)g。水合氯醛、青藤碱(纯度≥95%)、0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、胎牛血清均自北京索莱宝生物有限公司；DMEM-F12培养基、双抗(青链霉素)、白细胞介素(IL)-1β购自美国Invitrogen公司；聚合酶链反应(PCR)逆转录及mix试剂盒购自南京诺唯赞生物公司；IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、基质金属蛋白酶(MMP)-13、聚蛋白多糖酶(ADAMTS)5的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒及核转录因子(NF)-κB、IκB、IκK二抗购自美国Proteintech公司；NF-κB、IκB、IκK一抗购自美国CST生物公司；CCK-8检测试剂盒购自日本Dojindo公司。

1.2大鼠椎间盘终板软骨细胞提取与培养 使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后逐层切开大鼠背部，显露椎间盘，取出并放入含有1%双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)冰盒中，并迅速转移至超净台内。PBS清洗椎间盘表面，去除肌肉、滑膜等软组织，取出软骨组织转移至另一培养皿中，再次加入含1%双抗的PBS，清洗3次后使用眼科剪将软骨组织剪成1×1×1 mm3大小的碎块，加入0.2%的Ⅱ型胶原酶消化6 h后将悬液倒入120目不锈钢滤网过滤。将滤过的悬液使用离心机100 r/min离心5 min，吸弃上清后加入PBS清洗，再次予以离心5 min后加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM-F12培养基重悬。吹打混匀后接种于培养皿中，放入恒温培养箱中孵育。每2～3 d换液1次，细胞铺满培养皿的80%～90%时用胰酶消化传代并记为第1代，取第3～5代细胞用于实验。

1.3CCK-8法检测不同浓度青藤碱对软骨细胞活力的影响 取培养后第3～5代软骨细胞并接种于96孔板中，孵育24 h后分别加入不同浓度的青藤碱(0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L)，再次孵育24 h后向每孔加入10 μl CCK-8。放入培养箱中再次孵育3 h后放于酶标仪中检测各孔在450 nm的吸光度，计算各浓度青藤碱对软骨细胞活力的影响。

1.4细胞分组与干预 将软骨细胞分为5组，即对照组、IL-1β组、0.1、0.5、1.0 mmol/ml青藤碱组。除对照组外，其余4组均予以IL-1β(1 μg/ml)干预模仿终板软骨退变环境。

1.5ELISA检测不同浓度青藤碱对IL-1β诱导后软骨细胞上清中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5的影响 收集各组干预后细胞上清，使用ELISA检测各组IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5含量，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量后操作步骤严格按照ELISA试剂盒中操作说明书执行。

1.6qPCR检测不同浓度青藤碱对IL-1β诱导后软骨细胞中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5的影响 干预24 h后加入PBS洗涤，弃PBS后加入1 ml Trizol，将细胞吹打悬浮并移入1.5 ml离心管中，静置20 min后加入0.2 ml氯仿，混匀后静置5 min，随后于12 000 r/min离心15 min。取上层水相并加入同体积异丙醇，再次混匀静置5 min，12 000 r/min离心10 min。弃上清后加入70%无水乙醇1 ml，混匀后7 500 r/min离心5 min，再次加入无水乙醇，离心后弃上清，所得沉淀即为mRNA，晾干加入20 μl DEPC水混匀，60℃金属浴10 min。使用分光光度仪检测mRNA浓度，按照逆转录试剂盒操作将其反转录为cDNA，随后按照说明书上机检测。引物序列：IL-6：上游5′-CTGCGCAGAATGAGATGA-3′，下游5′-CCAGAGCTGTGCAGATGA-3′；TNF-α上游5′-CGAGTGACAAGCCCGTAGCC-3′，下游5′-GGATGAACACGCCAGTCGCC-3′；MMP-13上游5′-CCAGAACTTCCCAACCAT-3′，下游5′-ACCCTCCATAATGTCATAC-3′；ADAMTS5上游5′-TATGTTCTCCA-GAGCGCAGC-3′，下游5′-GGAATCGTCATGGGAG-AGGC-3′；GAPDH上游5′-TCTCCTCTGACTTCAACAGCGAC-3′，下游5′-CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3′。

1.7Western印迹检测不同浓度青藤碱对IL-1β诱导后软骨细胞中NF-κB、IκB及IκK的影响 各组细胞干预24 h后弃上清，PBS洗涤后加入细胞裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)，冰上裂解30 min后12 000 r/min离心15 min，吸取上清并加入1/4上清体积上样缓冲液，100℃金属浴5 min后放入-80℃冻存。根据所测分子量大小选用8%～12%的分离胶进行电泳，随后将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，使用5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗放入4℃过夜，TBST清洗4次，5 min后二抗孵育1 h，再次使用TBST洗膜后加入电化学发光(ECL)上机显影。

1.8统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1CCK-8法检测不同浓度青藤碱对终板软骨细胞活力的影响 0.1、0.5、1.0 mmol/ml青藤碱组大鼠椎间盘终板软骨细胞增殖活力〔(1.19±0.02)%、(1.21±0.02)%、(1.32±0.03)%〕显著高于对照组或0 mmol/ml青藤碱组〔(1.00±0.00)%、(1.01±0.01)%〕，且呈浓度依赖性(均P<0.05)；5.0、10.0 mmol/ml青藤碱组大鼠椎间盘终板软骨细胞增殖活力〔(0.80±0.03)%、(0.68±0.04)%〕显著低于对照组或0.0 mmol/ml青藤碱组(P<0.05)。因此，选用0.1、0.5、1.0 mmol/ml青藤碱用于后续研究。

2.2ELISA检测青藤碱对IL-1β诱导后软骨细胞炎性因子及软骨退变的影响 IL-1β组细胞上清中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)，0.1、0.5、1.0 mmol/ml青藤碱组细胞上清中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5蛋白表达显著低于IL-1β组，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见表1。

2.3qPCR检测青藤碱对IL-1β诱导后软骨细胞炎性因子及软骨退变的影响 IL-1β组细胞上清中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5 mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)，0.5、1.0 mmol/ml青藤碱组细胞上清中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5 mRNA表达均显著低于IL-1β组(P<0.05)。见表2。故选用0.5、1.0 mmol/ml青藤碱用于后续研究。

2.4Western印迹检测青藤碱对IL-1β诱导后软骨细胞NF-κB通路的影响 IL-1β组终板软骨细胞NF-κB、IκK表达显著高于对照组，IκB表达显著低于对照组(P<0.05)；0.5、1.0 mmol/ml青藤碱组终板软骨细胞NF-κB、IκK显著低于IL-1β组，IκB表达显著高于对照组(P<0.05)。表明0.5、1.0 mmol/ml青藤碱可以明显逆转IL-1β诱导NF-κB信号通路激活。见表2，图1。

表1 ELISA检测各组IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5蛋白

表2 qPCR检测各组IL-6、TNF-α、MMP-13、ADAMTS5的mRNA水平及软骨细胞中NF-κB通路指标比较

3 讨 论

IVDD是引起下腰痛的主要疾病之一，有高达80%的成年人受到IVD的影响〔7〕。目前治疗IVDD的主要方法多为物理锻炼、抗炎止痛及手术〔8〕。然而手术作为治疗IVDD的终极方法，其仍然存在明显的并发症，如复发、疗效不满意、生物力学特性改变及加速周围结构的退变等〔9〕。终板软骨作为提供椎间盘营养的主要途径，其退变可显著降低营养物质的运输，最终导致IVDD〔2，3，10〕。而终板软骨细胞是终板软骨中唯一的细胞类型，具有分泌细胞外基质(ECM)及维持细胞稳态的重要作用，其炎症及退变与IVDD呈显著相关性〔11〕。此外，由于椎体终板软骨具有十分精细的血管供应至椎间盘，其可以通过全身给药将药物运输到椎间盘，这也使终板软骨成为减少IVDD的理想药物靶点〔12，13〕。IL-1β是导致椎间盘终板软骨炎症及退变的关键致炎因子，既往研究证明IL-1β干预后的软骨细胞可以出现明显的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等ECM主要组成成分的丢失，促进终板软骨发生退变；而退变的终板软骨可以进一步成为炎症介质来源，刺激IL-6、TNF-α等炎性因子大量释放，引起终板软骨细胞炎症，诱导的炎症可以促进软骨退变，引起椎间盘退变的级联反应〔8，14〕。研究认为可以使用IL-1β干预模拟体内终板软骨蜕变环境，建立终板软骨细胞体外退变模型〔8，15，16〕。MMPs及ADAMTS5是裂解蛋白聚糖的两大主要家族之一，其在终板软骨退变过程中起关键作用〔17～20〕。NF-κB信号通路是一类调控细胞免疫、炎症、生长、凋亡的信号通路，广泛参与人体生物学过程。在未激活的情况下，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合形成二聚体；当人体受到刺激时，IκB的激酶IκK可以激活IκB，使NF-κB从二聚体中解放并进入细胞核内，促进相关基因转录〔16，21〕。研究显示在退变的终板软骨细胞中，NF-κB呈明显高表达；而逆转NF-κB信号通路时，软骨退变显著降低〔22〕。

本研究结果提示合适浓度的(0.1、0.5、1.0 mmol/ml)青藤碱可以显著促进大鼠椎间盘终板软骨细胞增殖活力(P<0.05)，但浓度过高的(5.0 mmol/ml)青藤碱会抑制软骨细胞活力。随后以IL-1β干预建立椎间盘软骨退变模型，结果提示IL-1β诱导可以刺激终板软骨细胞产生炎症及退变，与研究〔8，15〕结果类似，说明造模成功；本研究结果说明青藤碱可以有效延缓IL-1β诱导终板软骨细胞炎症及退变；青藤碱可以通过抑制NF-κB信号通路激活达到治疗IL-1β诱导的椎间盘终板软骨细胞炎症及延缓软骨退变的疗效。

综上，青藤碱可以通过阻止NF-κB通路激活而抑制椎间盘终板软骨细胞炎症及退变，是一种治疗IVDD潜在药物。