阿尔茨海默病不同体外复合模型构建与初步比较

李红星 周学斌 张信岳 谷丽丽 鲁佳琪 李钦

(杭州医学院，浙江 杭州 310013)

阿尔茨海默病(AD)是一种常见且严重的神经退行性疾病，发病率与年龄高度相关。以记忆和认知功能障碍为特征的AD在影响病患生活质量的同时，也给各国的公共医疗带来了沉重的负担〔1〕。AD病因与机制报道不一，科学界目前尚未有定论。美国食品药品监督管理局(FDA)迄今仅批准了5个用于改善AD症状的药物，包括4个乙酰胆碱酯酶抑制剂和1个N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂〔2〕。因此，系统阐明AD的发病机制和开发安全有效的抗AD药物成为当下亟待解决的科研难题。

基于AD的多假说发病机制，体外复合模型能更全面地再现AD的病理特征，从而能更全面深入地筛选具有抗AD效果的神经保护剂。如Wei等〔3〕和魏恒云〔4〕曾将Aβ25～35和D-gal联合应用诱导PC12细胞损伤建立AD体外复合模型。Buendia等〔5〕曾将Aβ25～35和OA联合应用诱导SH-SY5Y细胞损伤建立AD体外复合模型。然而现有研究表明，AD体外复合模型并未广泛应用。衰老是晚发性AD的病理基础之一〔6〕，基于衰老的AD体外模型可以更好地模拟其病理分子层面的变化。本研究在D-半乳糖(D-gal)诱导细胞衰老的基础上，进行了体外复合模型的构建与初步比较。将D-gal分别与麦芽酚铝(Al(mal)3)、过氧化氢(H2O2)、冈田酸(OA)、谷氨酸(L-glu)和Aβ1～42联用，诱导PC12细胞损伤，从细胞损伤、氧化应激和细胞凋亡3个方面，确定AD体外复合模型构建的可能性与相关构建方法，为今后更深入的研究提供理论支持与参考。

1 材料与方法

1.1实验细胞 高分化大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞购自中国医学科学院细胞中心(中国北京)。

1.2试剂 MTT、人Aβ1～42、Hoechst 33342活细胞染色液均购自上海碧云天生物技术有限公司，D-gal购自Sigma，OA购自上海源叶生物科技有限公司，L-glu购自Solarbio，六水氯化铝(AlCl3·6H2O)、麦芽酚均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，H2O2溶液购自广东恒健制药有限公司，总超氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒与丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3实验仪器 NU-5510E细胞培养箱(Nuaire)；CJ-2F医用净化工作台(苏州市金燕净化设备工程有限公司)；DMI3000B 倒置荧光显微镜(Leica)；CytationTM1全自动细胞成像多功能检测系统(BIO-TEK)。

1.4细胞培养 PC12培养于DMEM完全培养基〔含10%胎牛血清(FBS)和1%青链霉素〕中。细胞于5% CO2，37℃条件培养，相对湿度为90%。取对数生长期细胞进行传代和实验。

1.5MTT实验筛选不同模型诱导剂造模浓度 分别设置溶剂对照组、空白对照组和模型诱导组，每组6个复孔。按照8×104个/孔将细胞消化后接种，溶剂对照组加入等量培养基，培养箱内培养24 h。各组弃上清，溶剂对照组和空白对照组每孔加入100 μl完全培养基，模型诱导组每孔加入100 μl不同梯度诱导液，孵育24 h后弃上清，加入20 μl MTT溶液，孵育4 h弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO) 100 μl振荡10 min，490 nm波长下测定OD值。细胞存活率(%)=(OD模型诱导组-OD溶剂对照组)/(OD空白对照组-OD溶剂对照组)×100%。

1.6MTT实验比较复合模型细胞损伤情况 分别设置溶剂对照组、空白对照组、D-gal诱导组、D-gal+Al(mal)3诱导组、D-gal+H2O2诱导组、D-gal+OA诱导组、D-gal+L-glu诱导组和D-gal+Aβ1～42诱导组。后续操作同“1.5”。

1.7一般形态学比较 分别设置空白对照组、D-gal诱导组、D-gal+Al(mal)3诱导组、D-gal+H2O2诱导组、D-gal+OA诱导组、D-gal+L-glu诱导组和D-gal+Aβ1～42诱导组。其中，各诱导剂浓度分别为，D-gal：120 mmol/L、Al(mal)3：800 μmol/L、H2O2：400 μmol/L、OA：160 nmol/L、L-glu：20 mmol/L、Aβ1～42：20 μmol/L。将对数生长期PC12细胞消化后接种，待细胞贴壁后，在对应浓度的诱导剂下孵育24 h，从培养箱中取出，显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.8氧化应激指标检测 实验分组和药物处理同“1.7”。各组弃去上清，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍，加入250 μl胰酶消化液，培养箱作用1 min，弃去，每孔加入500 μl裂解液〔0.5%聚乙二醇单辛基苯基醚(曲拉通100，Triton-X 100)+PBS〕，吹打收集于离心管，冰水中超声10 min。按照说明书检测各组T-SOD活力与MDA含量。

1.9Hoechst 33342染色检测细胞凋亡情况 实验分组和药物处理同“1.7”。各组加入等量Hoechst 33342染色液(1×)，轻柔混匀，于培养箱中孵育10 min。弃去上清，PBS清洗3遍，采用全自动细胞成像多功能检测系统进行成像观察。

1.10统计学方法 采用GraphPad Prism8软件进行统计，组间数据均采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1不同模型诱导剂造模浓度筛选 D-gal 0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mmol/L细胞存活率分别为：(100.0±1.4)%、(100.6±3.8)%、(100.4±5.8)%、(104.3±6.8)%、(101.3±11.9)%、(94.4±12.2)%、(90.1±9.5)%、(67.4±3.1)%、(50.5±1.3)%；Al(mal)3 0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0 μmol/L细胞存活率分别为(100.0±4.7)%、(96.5±6.4)%、(96.9±13.5)%、(96.0±11.6)%、(97.8±11.4)%、(91.0±8.0)%、(90.1±10.2)%、(74.0±5.5)%、(54.6±4.2)%；H2O20.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0 nmol/L细胞存活率分别为(100.0±1.5)%、(104.5±4.5)%、(101.6±3.2)%、(106.4±5.8)%、(105.7±6.4)%、(105.3±5.6)%、(106.9±4.6)%、(72.8±2.5)%、(21.8±2.0)%；OA 0、5、10、20、40、80、160、320 nmol/L细胞存活率分别为(100.0±6.1)%、(107.5±6.3)%、(110.0±2.4)%、(111.6±6.9)%、(110.9±5.2)%、(113.6±6.1)%、(89.9±4.2)%、(59.9±4.1)%；L-glu 0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 mmol/L细胞存活率分别为(100.0±4.0)%、(102.5±2.1)%、(93.7±6.0)%、(94.4±4.5)%、(85.9±5.5)%、(81.9±3.4)%、(74.5±2.8)%、(3.3±3.3)%；Aβ1～420.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L细胞存活率分别为(100.0±4.9)%、(97.3±2.8)%、(98.9±6.2)%、(100.4±4.1)%、(92.9±6.2)%、(79.5±3.9)%。综合后期实验进行优化，最终选择120 mmol/L的D-gal、800 μmol/L Al(mal)3、400 μmol/L的H2O2、160 nmol/L的OA、20 mmol/L的L-glu和20 μmol/L的Aβ1～42进行后续复合模型构建。

2.2复合模型细胞损伤情况比较 与空白对照组相比，D-gal组及D-gal与其他诱导剂联用时，细胞存活率均显著降低(P<0.01)，表明PC12细胞受到损伤。与D-gal组细胞存活率相比，D-gal+Al(mal)3组与D-gal+OA组细胞存活率明显降低(P<0.01)，表明细胞损伤程度加剧。其余组细胞存活率与单纯使用D-gal时相当。见表1。

2.3一般形态学比较 由图1可知，各组细胞形态较空白对照组均不同程度地变圆。与D-gal组相比，D-gal+Al(mal)3组和D-gal+H2O2组细胞间隙增大，变圆细胞比例增加。D-gal+OA组细胞突触消失，胞体显著变圆，同时少量胞体萎缩且形状不规则，表明细胞损伤程度加剧。D-gal+L-glu组和D-gal+Aβ1～42组较D-gal组无显著区别。

2.4氧化应激指标比较 与空白对照组和D-gal组相比，D-gal+OA组MDA含量明显升高(P<0.01，P<0.05)。D-gal+Al(mal)3组、D-gal+H2O2组和D-gal+OA组T-SOD活力较空白对照组和D-gal组均显著降低(P<0.01)。见表1。表明D-gal与三者的分别联用可加剧细胞内氧化应激水平。

2.5细胞凋亡情况比较 由图2可知，与空白对照组相比，D-gal组部分细胞的细胞核呈致密浓染，表明细胞开始出现凋亡。与D-gal组相比，各联合诱导组出现不同程度的蓝色荧光表达增强，细胞核致密浓染水平明显升高。其中，D-gal+H2O2组和D-gal+OA组核染数目明显减少，表明细胞凋亡比例增加。此外，D-gal+OA组细胞核部分可见碎块化致密浓染，表明细胞凋亡水平进一步升高。

表1 AD体外复合模型细胞存活率及MDA含量和T-SOD活力比较

图1 各组细胞形态学比较(×10)

图2 各组细胞凋亡情况(DAPI，×10)

3 讨 论

AD体外研究中，两种造模剂联合应用，能更好地模拟出AD的相关特征。衰老是一种与年龄高度相关的生理功能衰退过程，也是晚发性AD的主要危险因素之一〔7〕。D-gal作为一种衰老诱导剂，在AD体内模型构建中广泛应用，但在体外建模的相关研究中报道较少。

研究发现，细胞外Aβ寡聚体和细胞内神经纤维缠结会导致神经元损伤，进而引发神经元变性和突触功能障碍，推动AD发生发展进程〔8，9〕。因此，研究人员通常在体外采用某些诱导剂作用于神经细胞来模拟AD的病理特征。通过分析细胞损伤情况和观察形态特征来反映模型的最终构建情况。本研究MTT实验结果表明，D-gal+Al(mal)3组与D-gal+OA组细胞损伤程度加剧。镜下形态观察可见，D-gal+Al(mal)3组和D-gal+H2O2组细胞损伤程度进一步升高。

研究表明，氧化应激与AD密切相关，如在AD患者和AD动物的脑中都检测到了诱导氧化应激的活性氧(ROS)水平升高〔10，11〕。因此，氧化应激水平也是AD模型构建过程中需要进行考察的一个方面。本研究实验结果，D-gal+Al(mal)3组、D-gal+H2O2组和D-gal+OA组细胞内氧化应激水平升高。

神经元凋亡和随之发生的神经受损是AD患者出现认知与记忆功能障碍的主要原因之一〔12〕。通过分析神经元凋亡水平可以间接反映AD病理损伤程度。本研究中，细胞凋亡染色结果表明，各组诱导组细胞核均出现不同程度地致密浓染，表明各组细胞出现不同程度地凋亡，其中D-gal+OA组细胞可见碎块化致密浓染，表明细胞凋亡程度与其他组相比进一步加剧。

综上，D-gal与Al(mal)3、H2O2或OA分别联用可以加剧细胞损伤、氧化应激和细胞凋亡程度，相比于单一的AD体外损伤模型更具优势。这将为相关研究者在AD机制研究和抗AD药物初步筛选研究上提供更多的模型选择，也为更深入系统的研究AD体外复合模型提供了理论依据和支持。