SMAD4 在KRAS、BRAF 基因突变结直肠癌中的表达及临床意义

张琳，陈祥义，杨宏杰，李鑫

结直肠癌（CRC）由于其高发病率和死亡率，已成为一个主要的公共卫生问题[1]。最新数据显示，男性和女性的CRC新发病例数和死亡病例数均处在第3位[2]，严重危害人类健康。与其他恶性肿瘤相比，CRC 具有更高的肿瘤内异质性和更高的肿瘤突变负荷[3]，其发生发展是多因素参与作用的过程。

KRAS 和BRAF 编码属于RASRAF-MEK-ERK 信号通路的下游蛋白，该信号通路的过度激活在肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移中起重要作用，KRAS和BRAF突变导致该通路的持续激活并加速CRC 的进展[4]。目前临床研究证实，存在RAS、BRAF 突变的CRC患者不能从EGFR靶点的靶向治疗中受益，但是针对KRAS、BRAF 基因的靶向治疗比较困难，主要是由于信号通路之间的交联、下游效应因子的激活以及反馈环激活等多种因素使得临床获益不理想，因此寻找分子靶向治疗的潜在靶点极具迫切性和必要性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019 年1 月至2020 年12 月于嘉兴学院附属医院手术切除的CRC标本185 例，其中男122 例，女63 例；年龄为28～92 岁，平均（65.9±11.2）岁。所有标本均常规行中性甲醛固定、石蜡包埋、切片及HE 染色，由病理医师复阅切片明确诊断，并确定有足够的肿瘤细胞再进行后续检测。本研究获得嘉兴学院附属医院医学伦理委员会的批准（LS2021-XJS-132）。

1.2 主要试剂 核酸提取试剂盒（型号：FFRE DNA）、人类KRAS 基因突变检测试剂盒（荧光PCR 法）、人类BRAF基因V600E 突变检测试剂盒（荧光PCR法）均购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司，SMAD4 单克隆抗体（B-8，sc-7966）购自Santa Cruz公司，免疫组织化学二抗显示系统Real EnVision K5007购自DAKO 公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 显微镜下观察HE切片，选取肿瘤细胞比例达到20%以上的区域，尽量避开非肿瘤区、坏死出血区等。将石蜡包埋CRC 组织切成5 m 厚的切片，使用刀片刮取与标记区域相对应的组织，并转移到标记的EP 管中，然后按照厦门艾德生物科技有限公司的核酸提取试剂说明书进行操作。用Nanodrop2000 紫外可见分光光度计对DNA含量进行定量，DNA 浓度大于2 ng/ l，OD260/OD280 介于1.8～2.0 之间。

1.3.2 PCR扩增 采用扩增阻滞突变分析系统（ARMS）法检测KRAS基因突变和BRAF 基因第15 外显子V600E 热点突变。按照厦门艾德生物科技有限公司的基因突变检测试剂盒说明书进行操作，在PCR 反应中设立阳性对照和阴性对照，共同进行检测和分析。PCR 扩增过程：第一阶段95℃5min，1个循环；第二阶段95℃25s，64℃20s，72℃20s，15个循环；第三阶段93℃25s，60℃35s，72℃20s，31 个循环。第三阶段60℃时收集FAM 和HEX 信号。

1.3.3 免疫组织化学染色 组织切片65℃烤片2 h，常规脱蜡脱水，用EDTA修复液（pH9.0）在95℃～100℃水煮下进行抗原修复20 min，3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶10 min，滴加一抗SMAD4（1∶400），用PBS 代替一抗作为阴性对照，室温孵育1h，二抗显示依据Real EnVisionK5007 试剂盒操作，二抗室温孵育20 min，以1∶100 配制DAB显色液，显微镜下控制显色时间，然后苏木素复染、梯度乙醇脱水、透明、封片。

1.3.4 免疫组化结果判定 由2 位高级职称病理科医师在双盲条件下，采用半定量方法评估SMAD4 染色强度：如非肿瘤黏膜中的强表达（强）；表达减少（弱），强度低于正常黏膜；没有染色（缺失）。肿瘤细胞表现出的SMAD4 表达丧失的百分比被单独评分，≥5%的肿瘤细胞没有SMAD4 表达的病例被归类为SMAD4 表达缺失。＞95%强表达的肿瘤细胞的病例被归类为强SMAD4 表达，而其他病例被归类为弱SMAD4 表达。如果免疫染色强度正常，则肿瘤被归类为具有完整SMAD4 表达（SMAD4阳性）；如果免疫染色强度弱或不存在，肿瘤被归类为具有低SMAD4 表达（SMAD4 阴性）[9]。

1.4 统计方法 采用SPSS19.0 软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t 检验，多组比较采用单因素方差分析；计数资料采用2检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KRAS、BRAF 基因突变情况 82例检测到KRAS 基因突变，突变率为44.3%（82/185），突变主要位于第2 号外显子，突变率为41.1%（76/185），其中以第2 号外显子的第12 和13 密码子的突变最为多见。9 例检测到BRAF 基因突变，突变率为4.9%（9/185），KRAS 基因与BRAF 基因无共同突变。

2.2 SMAD4 在CRC 中的表达情况SMAD4 的表达主要定位于细胞质和细胞核中。免疫组化检测到63 例SMAD4（34.1%）表达正常（SMAD4 阳性），而122 例SMAD4（65.9%）表达微弱或缺失（SMAD4 阴性）。两位病理医师之间判读的一致性为0.880.75，95% CI ：0.59～0.78）。见封三彩图3。

图3 SMAD4 在结直肠癌组织免疫组化分析中的表达（苏木素，×20）

2.3 SMAD4 的表达与CRC 患者临床病理特征的关系 SMAD4 的表达与患者的年龄、性别、肿瘤的分化程度以及BRAF状态无关（均P＞0.05），与肿瘤位置、TNM 分期、淋巴结转移以及KRAS状态显著相关（均P ＜0.05）。见表1。

表1 SMAD4 表达与临床病理特征的相关性 例（%）

3 讨论

CRC 是一种异质性疾病，其发病机制涉及一系列调节细胞增殖、凋亡和血管生成的遗传和表观遗传修饰[10]，一些致癌基因和抑癌基因，如TP53、APC、KRAS、NRAS、PIK3CA 和SMAD4 等，都参与了它的发展[11-13]。RAS 和BRAF是位于表皮生长因子受体（EGFR）信号级联下游的两个原癌基因，它们的突变导致EGFR通路的组成型激活和结直肠肿瘤发生。临床上只有RAS 和RAF 基因野生型患者才对抗EGFR单抗药物治疗有效，而突变型无效[14]。因此寻找分子靶向治疗的潜在靶点变得极为迫切。

SMAD4 是位于染色体18q21 上的抑癌基因，是转化生长因子TGF-的下游效应分子，被跨膜丝氨酸-苏氨酸受体激酶磷酸化和激活，在TGF-通路的转录调节复合物中作为共同介质发挥重要作用，包括抑制细胞生长、增殖、分化、细胞凋亡和上皮间质转化（EMT）等。Mei等[15]认为SMAD4 突变可能是基于西妥昔单抗的治疗预后不良的潜在生物标志物，这需要在更大的患者队列中进一步验证。Lin 等[16]发现沉默SMAD4 通过促进EMT 降低CRC细胞对西妥昔单抗的敏感性，而Smad4 的高表达可能在临床上有益于基于西妥昔单抗的治疗。这些发现表明SMAD4 致病变异在肿瘤进展和靶向治疗CRC 患者中发挥关键作用。Safina 等[17]发现TGF-诱导的EMT不足以获得侵袭潜力，而激活的RAS会改变反应，赋予致瘤和侵袭潜力。因此，Ras-Raf-MAPK和TGF-/Smad级联之间的协同作用是获得癌症侵袭性表型的必要条件。

本研究检测了185 例CRC 患者石蜡标本中KRAS、BRAF 基因突变情况，结果显示KRAS 基因突变率为44.3%，第2 号外显子突变率为41.2%，以第12和13 密码子的突变最为多见，BRAF基因突变率为4.9%。KRAS、BRAF 突变在CRC 中是相互排斥的[18]，伴随KRAS和 BRAF 突变的 CRC 极为罕见（0.001%），通常与更晚期的分期相关[19]，以上这些结果与文献报道相符[20]。接下来笔者分析了SMAD4 在CRC 中的表达情况，结果显示63 例（34.1%）SMAD4表达正常（SMAD4 阳性），而122 例（65.9%）SMAD4 表达微弱或缺失（SMAD4 阴性）；同时笔者分析了SMAD4 与CRC临床病理参数之间的关系，结果显示具有更高的病理TNM 分期、肿瘤发生在结肠、有淋巴结转移并且存在并发KRAS突变的患者SMAD4 表达越低，提示SMAD4 低表达或丧失与结直肠癌预后不良有关，也就是说导致蛋白表达低或缺失的SMAD4 突变与不良预后有关。这与 Fang 等[21]发现SMAD4 突变与OS、PFS/RFS 和临床病理参数包括肿瘤部位、疾病分期、RAS状态、淋巴结转移和黏液分化相关的研究基本一致。但SMAD4 基因对BRAF 状态的影响仍有待进一步阐明。

由于SMAD4 与KRAS突变密切相关，它们的关系值得进一步研究。发生该作用的可能机制为：RAS 的表达上调磷酸酪氨酸激酶受体ERBB1（EGFR）和ERBB2（HER2）的表达并诱导侵袭性表型。Smad4 依赖性信号转导负调节这些受体的表达并抑制Ras 诱导的EGFR 和ERBB2 上调，从而发挥抗增殖作用。K RAS突变和SMAD4 信号的丧失协同上调EGFR 和ERBB2 的异常表达，导致肿瘤的发展和原发肿瘤的转移和扩散[22-23]。

综上所述，SMAD4 对于研究CRC的发生、发展以及临床预后判断和治疗均有重要意义。尤其是在 Ras-Raf-MAPK 信号转导通路中的作用，将是下一步研究的重点。对于CRC 的个体化治疗，SMAD4 作为驱动突变，可能成为CRC 精准医疗的新靶点。