50 种中药提取物体外抗菌活性研究

李 哲，杨寒淞，曹应葵，范青飞，李玉叶

（1.昆明医科大学第一附属医院皮肤科，云南 昆明 650032；2.中国科学院西双版纳热带植物园，热带植物资源可持续利用重点实验室，云南 勐腊 666303）

我国是抗生素使用大国，世卫组织一项研究表明，我国住院病人抗生素使用率高达80.00%［1］，中国细菌耐药率高达45.00%，远高于欧美国家，而抗生素滥用带给人体的伤害也是不可估量的［2］。鉴于全国各地如此严重的抗生素耐药状况，并且抗生素存在多重耐药以及交叉耐药的情况下，亟需寻找不同靶点、不同作用机制的抗菌药物。大量研究表明中药的天然产物具有良好的抗菌活性，并可以逆转耐药，因此我们应充分利用中医药宝藏，研究具有抗菌作用的中药及提取物，为新药研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 淋球菌ATCC-49226 来源于云南省疾病预防与控制中心；金黄色葡萄球菌ATCC-12228、光滑念珠菌ATCC-66032、白念珠菌ATCC-14053 来源于昆明医科大学；新型隐球菌ATCC-32045 来源于昆明医科大学第一附属医院。

1.1.2 主要仪器、设备 二氧化碳恒温培养箱购自美国Forma Scientific 公司；比浊仪、麦氏管购自中国珠海迪尔生物工程有限公司；移液器购自美国Eppendorf 公司；生物安全柜购自美国Labconco 公司。

1.1.3 中药提取物及其制备

1.1.3.1 提取物 ① 乙醇提取物：紫草素、桂皮醛、巴西苏木素、竹叶椒、贵州花椒、刺异叶椒、异叶花椒、毛刺花椒、菱叶花椒、滇丹参叶。以上由中国科学院西双版纳热带植物园提供。② 其他提取物：云南红豆杉、清明花、白钩藤、两面针、定心藤、青牛胆、傣百解、黑皮跌打、鸦胆子，以上由中国科学院西双版纳热带植物园提供。③ 茶提取物：茶黄素类、茶褐素类、茶红素类、咖啡碱类由云南汉德生物技术有限公司提供。

1.1.3.2 中药提取物制备方法 ① 乙醇提取物：分别将10 种中药（紫草、桂皮、苏木、竹叶椒、贵州花椒、刺异叶椒、异叶花椒、毛刺花椒、菱叶花椒、滇丹参叶）粉碎成粗粉，用95 %的乙醇浸泡3 次，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪减压，回收溶剂，得到提取物。上述提取物以无菌生理盐水 （含5%二甲基亚砜助溶剂） 配成浓度为 1 mg/ml 的溶液作K-B纸片法初筛用。② 其他提取物：分别将9 种中药（云南红豆杉、清明花、白钩藤、两面针、定心藤、青牛胆、傣百解、黑皮跌打、鸦胆子）粉碎后，用甲醇提取，然后将甲醇提取物溶解在甲醇和水（9：1）的混合溶剂中，用石油醚萃取，得到石油醚提取物。甲醇和水层脱溶后，加水溶解，然后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，上述中药就得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水四个部位提取物。上述提取物用无菌生理盐水（含5%二甲基亚砜助溶剂）配成浓度为 1 mg/ml 的溶液作K-B 纸片法初筛用。③ 茶提取物：将普洱茶粉碎成粗粉，加入蒸馏水浸提回流，滤液进行一次萃取，得到的有机相加入氯仿萃取、浓缩，得到咖啡碱类；将水相进行二次萃取，得到的有机相加入正丁醇萃取、浓缩，得到茶红素类、茶黄素类；将二次萃取得到的水相进行三次萃取，得到的水相浓缩蒸干，得到茶褐素类。上述提取物用无菌生理盐水（含5%二甲基亚砜助溶剂）配成浓度为 1 mg/ml 的溶液作K-B 纸片法初筛用。

1.1.4 培养基 沙氏培养基、LB 培养基、琼脂粉购于北京酷来搏科技有限公司；淋球菌GC 培养基及Isoviatale X 增菌剂、抑菌剂购自广东环凯微生物科技有限公司；10%脱纤维新鲜羊血购自南京便诊生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 K-B 纸片法抑菌实验

1.2.1.1 制备菌悬液 从固体培养基中挑取菌落于液体培养基，置于35℃摇床250 r/min 摇速下培养至对数生长期，离心去上清，加入无菌生理盐水混匀，校正细菌悬液浓度至1×108个/ml。

1.2.1.2 菌液接种 每个平板各加载菌液250 μl，用无菌棉拭子涂板，用镊子加载直径为6 mm 的无菌滤纸片。用移液器吸取10 μl 中药提取物分别滴入2个滤纸片的正中心，生理盐水组为空白对照，细菌用氨苄西林为阳性对照，真菌用氟康唑作阳性对照。

1.2.1.3 观察结果 在37℃培养箱孵育（20 ～24）h，读取抑菌圈的直径，抑菌圈直径包括纸片的直径。

1.2.2 肉汤稀释法检测最小抑菌浓度（MIC） 通过K-B纸片法筛选出对上述有较强抗菌活性的中药提取物后，根据CCLSI M27-A3 用肉汤稀释法测定植物提取物对除淋球菌外其他几种菌的最小抑菌浓度。

1.2.2.1 待测样品溶液配制 取100 mg/ml 中药提取物储存液，用液体培养基稀释成8 mg/ml；氨苄西林、氟康唑均用培养基稀释为8 mg/ml（DMSO 占最终体积的浓度≤2%）。

1.2.2.2 菌悬液制备 取培养基上37℃培养（2-3）代的纯菌落制成菌悬液，浓度调整至1×105-2×105CFU/ml。在血球计数板上计出真菌浓度，浓度调整为2×106-5×106CFU/ml。

1.2.2.3 倍比稀释药物浓度 取96 孔板，在每行（1-12）号孔分别加入100 μl 液体培养基，在1 号孔加入待测样品溶液100 μl，混匀后取100 μl 加入2 号孔，2 号孔混匀后取100 μl 加入3 号孔…直至10 号孔。在（1-11）号孔分别加入80 μl 配置好的菌悬液，再加20 μl Alamar Blue。第11 号孔只加菌悬液，第12 号孔只加培养基。

1.2.2.4 结果判读 将96 孔板置于37℃恒温箱孵育（16-48） h，观察孔里颜色变化，当孔中有菌生长时，Alamar Blue 会由蓝色变为红色，因此最小抑菌浓度应为最后一个颜色为蓝色孔的浓度。

1.3 琼脂稀释法检测淋球菌MIC 通过K-B 纸片法筛选出对淋球菌有较强抗菌活性的中药提取物后，再通过琼脂稀释法检测提取物对淋球菌的MIC。提取物用无菌GC 培养基稀释，每种提取物的浓度梯度设置为32 mg/ml、16 mg/ml、8 mg/ml……0.25 mg/ml， 在每个平皿中加入1×107CFU/ml 的细菌10 μl，试验设空白对照。37℃培养24h，分别转种GC 琼脂平板培养基，24 小时后无细菌生长的平皿则为药物最低浓度。

2 结果

2.1 K-B纸片法 检测50种中药提取物的抗菌活性，发现紫草素、桂皮醛在1mg/ml 浓度下有抑菌活性，其余提取物无抑菌活性（见表1）。判断标准依据美国临床实验室标准化委员会 M27-A3 方案［3］。

表1 50 种中药提取物抗菌活性

注：T 表示总提取物，P 表示石油醚萃取物，E 表示乙酸乙酯提取物，B 表示正丁醇提取物，W 表示水提物

2.2 肉汤稀释法测MIC 用肉汤倍比稀释法测紫草素和桂皮醛对金黄色葡萄球菌、白念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌的MIC 值，结果为：紫草素对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为7.81 μg/ml，对白念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌最小抑菌浓度均为15.625 μg/ml。桂皮醛对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为160 μg/ml，对白念珠菌、光滑念珠菌最小抑菌浓度为250 μg/ml，对新型隐球菌无抑制作用。

2.3 琼脂稀释法测MIC 用琼脂稀释法测紫草素对淋球菌的最小抑菌浓度为1mg/ml，桂皮醛对淋球菌无抗菌作用。

3 讨论

近年来，随着各类抗生素在临床上的广泛应用，细菌、真菌对常用抗生素的耐药性也逐年攀升。我们课题组已发现云南地区淋球菌耐药现状为：环丙沙星耐药率100%、四环素耐药率89.9%、青霉素耐药率89.3%、阿奇霉素耐药率14.5%，其中多重耐药株占比73.6%［4］。因此，在现有抗生素对耐药菌的治疗效果不佳，且研发新型抗菌药物难度大、周期长的背景下，加强对中药抗菌活性的研究和开发，对解决细菌耐药问题具有重要意义。中药是中华民族的瑰宝，目前，已有大量研究证实中药单体、复方或中药提取物中的活性成分具有明显抗菌作用，并已广泛应用于临床。已被证实的中草药抗耐药菌的作用机制主要包括消除耐药质粒、影响细菌细胞膜的通透性、抑制细菌体内酶的活性、影响蛋白质和核酸的合成、抑制耐药菌外排泵等［5］。中药配伍也由于其通过多靶点、多途径抗菌而具有毒性低、不易诱导耐药等特点。

紫草是紫草科紫草属植物，在我国有悠久的药用历史，有凉血活血、清热解毒等功效，民间将其外用于外生殖器部位来治疗感染。紫草中脂溶性的醌类化合物为其主要活性成分，包括紫草素类及其二聚体、紫草呋喃类、苯醌类等混源萜类化合物。紫草素是1，4－萘醌的烷基化衍生物，化学式为C16H16O5。近年来随着对紫草研究的不断深入，发现紫草素具有抗菌、抗炎［6］、抗肿瘤活性［7］，还有抗氧化损伤［8］以及抗病毒［9］作用。本次研究中，我们发现紫草素对金黄色葡萄球菌、淋球菌、白念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌均具有抑制作用。先前的研究表明紫草素通过改变白念珠菌的细胞膜通透性，使细胞内Ca2+外流，从而发挥抗白念珠菌的作用。也有研究者发现紫草素可以改变耐甲氧西林金黄色葡萄球菌肽聚糖的亲和力、细胞质膜的渗透性和ATP结合转运蛋白的活性，从而抑制其生长［10］。桂皮醛又名肉桂醛、苯丙烯醛、桂醛，来源于天然植物桂枝或肉桂中，是从肉桂树中提取的烯醛类有机化合物，其化学分子式 C9H8O。国内外对桂皮醛的大量药理研究表明，其具有抗菌、抗炎、解热镇痛、抗肿瘤、降糖、抗肥胖等多种药理活性［11］。本次研究证明了桂皮醛对金黄色葡萄球菌、白念珠菌、光滑念珠菌有抑制作用，有研究者发现桂皮醛直接作用于真菌细胞膜表面的中药成分麦角甾醇，改变细胞的膜完整性、流动性、细胞活力等，从而抑制真菌生长，除此之外，还发现桂皮醛对耐氟康唑的白念珠菌仍有抑制作用［12］。有研究表明亚抑菌浓度的桂皮醛能够抑制金黄色葡萄球菌的α-溶血素、肠毒素A 和B 的产量，从而抑制金黄色葡萄球菌的生长［13］。本研究中傣百解、定心藤、白钩藤、黑皮跌打等药物是我国傣族医药的常用药材，在本次研究中并未发现其具有抗菌活性，但其药用价值仍不可忽视。

紫草素、桂皮醛对金黄色葡萄球菌、白念珠菌、光滑念珠菌均有抗菌活性，紫草素对淋球菌和新型隐球菌也有抗菌作用，可对药物研发提供参考。