滇黄精多糖提取工艺及其抗氧化活性研究

肖坤敏 马佳钰 王军民 毕雪琼 刘 艳 华 燕

（西南林业大学林学院，云南森林资源培育与利用协同创新中心，云南 昆明 650233）

滇黄精（Polygonatum kingianum），百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum）多年生草本植物，主产于云南、四川和贵州等地区[1]。滇黄精以根茎入药，名为黄精，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效[2]。滇黄精富含多糖、甾体皂苷、黄酮、生物碱、氨基酸和微量元素等活性成分[3]，其多糖作为主要活性成分，主要由中性糖和酸性糖组成[4]，具有增强免疫能力[4]、抗肿瘤[5]、抗衰老[6]、抗糖尿病[7−8]及抗炎[9]等药理作用，可广泛应用于新型药物、功能性食品、化妆品和保健品中。

近年来，黄精多糖提取的方式多以热水提取法[10]为主，微波提取、超声提取和酶提取等辅助提取方法次之[11−13]，各提取方法提取效率不同，都存在各自优势和劣势。与热水提取法相比，超声辅助提取法受限于设备条件，目前不能应用于大规模工业生产；微波辅助提取法料液比较大，后续处理程序繁琐；酶提取法用于大规模生产时酶用量较大，出现将灭活的酶彻底清除的问题难以解决。并且黄精多糖复杂的结构和广泛的生物活性成为众多科研工作者研究的热点，但对滇黄精多糖纯化前后抗氧化活性的研究较少。因此，本研究主要采用传统的热水提取法对滇黄精中的多糖进行提取，采用响应面试验设计，优化提取参数，获得最佳的提取工艺，并对提取的粗多糖进行纯化，开展纯化前后抗氧化（ABTS+·自由基清除能力）活性研究。此方法操作简单，安全环保，对提取设备要求不高，可应用于工业生产，为滇黄精资源开发利用和工业生产提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及设备

Evolution 300 紫外分光光度计（Thermo Fisher，美国）；DHG−9030A 型不锈钢高温干燥箱（河南马弗炉技术开发有限公司，中国）；Heidolph Digital 旋转蒸发仪（Heidolph Group，德 国）；BK−300GDE 超声波清洗器（陕西凯德力环保科技有限公司，中国）；DEAE纤维素（上海金穗，中国）；半透膜（上海生工，中国）；无水乙醇（上海源叶生物科技有限公司，中国）等。滇黄精采自云南省石屏县龙鹏镇，由昆明植物所纪运恒研究员鉴定为百合科植物滇黄精。

1.2 实验方法

1.2.1 滇黄精的预处理

将新鲜滇黄精根茎去除表面泥土，洗净，切片，自然风干，70 ℃干燥箱恒温烘干，粉碎，过80目过筛备用。

1.2.2 滇黄精多糖的提取

精确称取干燥滇黄精粉末1.003 g于150 mL锥形瓶中，加蒸馏水置于水浴锅中水煎提取，待水浴完成，过滤，用蒸馏水洗涤，将全部滤液放入100 mL容量瓶，定容，得滇黄精多糖提取液，备用。

1.2.3 多糖含量的测定

采用苯酚−硫酸法[14]，对滇黄精多糖进行测定。精确称取在95 ℃下烘干至恒质量的葡萄糖2.500 g，用蒸馏水溶解，定容于500 mL量瓶中，取2 mL至100 mL容量瓶，定容，即得浓度为100 μg/mL葡萄糖标准溶液。分别移取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL葡萄糖标准溶液于10 mL试管中，用蒸馏水补至2 mL，加入1 mL 5% 苯酚，再加入5 mL 98% 浓硫酸，立即振荡摇匀，静置30 min。以2 mL的蒸馏水做空白组，在波长490 nm条件下测定各个试管内溶液的紫外吸光度，每组3个平行。以葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A＝0.0153x−0.0149（R2=0.9995），在此浓度范围内（15～90 μg/mL）葡萄糖溶液浓度与吸光值呈良好的线性关系。

准确取滇黄精多糖定容后提取液1.0 mL，于100 mL容量瓶用蒸馏水定容，摇匀，按照绘制标准曲线下操作测定其在490 nm 处的吸光值，根据回归方程计算滇黄精多糖提取率，其计算公式为（1）。

式中：C为提取液中多糖的浓度；V为多糖提取液的总体积；N为稀释倍数；M为样品粉末质量。

1.2.4 单因素实验

取干燥滇黄精粉末1 g于锥形瓶中进行各组单因素试验。1）料液比。固定提取时间1.5 h、提取温度70 ℃，料液比分别取1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL进行5组实验，每组3次平行试验。2）提取时间。固定料液比最优的、提取温度70 ℃，提取时间分别取0.5、1、1.5、2、2.5 h进行5组实验，每组3次平行试验。3）提取温度。固定料液比最优、提取时间最优，提取温度分别取50、60、70、80、90 ℃进行5组实验，每组3次平行实验。

1.2.5 响应面实验

在单因素试验结果基础上，选取对滇黄精多糖提取效果影响较大的因素料液比、时间、温度为自变量，记为X1、X2、X3，以多糖提取率（Y）为响应值，根据响应面 Box−Behnken 中心组合试验设计原理，进行3因素3水平优化试验，试验因素与水平见表1。

表1 响应面因素与水平Table 1 Response surface factors and levels

1.2.6 滇黄精多糖的纯化

参照文献[15]方法，对滇黄精多糖纯化，操作流程如图1所示。将用最优条件提取滇黄精多糖提取液浓缩，回收至15 mL体积，冷却至室温，加入95%的乙醇至乙醇分数为65 %，进行醇沉，加入后有紊状飘浮物出现，捞出，无水乙醇清洗。其余母液静置24 h后过滤，沉淀用无水乙醇反复冲洗，合并2次所得沉淀，溶解加入Sevage试剂（氯仿，正丁醇体积比4∶1）按4∶1体积比混合，强烈震荡30 min，用3000 r/min离心15 min，直至分层后弃去中间的蛋白质层和下层的Sevage溶液，上层多糖溶液继续加入Sevage试剂重复4次，直至不再出现蛋白层为止。合并多次的粗多糖溶液，减压浓缩成干燥粉末，得滇黄精粗多糖，记为PKP。

图1 滇黄精多糖纯化流程图Fig. 1 Purification flow of polysaccharides from P. kingianum

将DEAE纤维素装入规格为3 cm × 50 cm的层析柱中，用蒸馏水冲洗多次，过夜平衡。用去离子水将脱蛋白粗多糖溶解，以粗多糖浓度为10 mg/mL上样体积20 mL，分别用去离子水和0.5 mol/L NaCl进行洗脱，以洗脱速度2 mL/min冲洗，100 mL收集1瓶，用紫外监测多糖含量，合并含量较高的部分，最后得到水洗脱部分（中性多糖）和盐洗脱部分（酸性多糖）。盐冲洗部分用去离子水透析至无盐检出。记为PKP−水和PKP−盐，用于抗氧化测定。

1.2.7 滇黄精多糖抗氧化活性测定

参考文献[16]方法，准确吸取PKP、PKP−水和PKP−盐配制成相应质量浓度的待测液2 mL，然后加入2 mL预先已经混合好的ABTS反应试剂，混合均匀，避光室温下反应5～6 min，在波长734 nm处测定各组分样品的吸光度值（A1）。用无水乙醇2 mL代替ABTS反应剂，步骤同上，于波长734 nm处测得各组分样品本身吸光度值（A2）。以2 mL无水乙醇与2 mL ABTS反应剂充分混合，重复同上步骤，测其在734 nm波长处的吸光度值（A0）。以同等体积蒸馏水作为参比液调零。以Vc作对照，每个分析样品重复3次，取平均值。按公式（2）计算清除率。

1.3 分析方法

单因素试验结果利用SPSS 20.0应用软件，进行单因素方差分析，响应面试验应用 Design Expert 8.0.6进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同料液比对滇黄精多糖提取率的影响

由图2 可知，料液比对滇黄精多糖提取率存在极显著差异（P<0.01）。滇黄精多糖提取率随料液比增加而先显著增加后趋于平缓，可能是溶剂量过多会形成稀释效应，当多糖全部溶出，再增加溶剂也不会继续溶出多糖，提取率先增加后趋于平缓，并且可能会溶出一些水溶性杂质，影响多糖纯度，提取率增加趋势平缓。由于溶剂少时，多糖溶液粘稠不易操作，综合考虑，料液比选择 1∶50（g/mL）为宜，此时提取率为19.35%。

图2 不同料液比对滇黄精多糖提取率的影响Fig. 2 Effects of different solid-liquid ratios on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

2.1.2 不同提取时间对滇黄精多糖提取率的影响

由图3可知，滇黄精多糖提取率受提取时间因素影响（P<0.05）。多糖提取率随提取时间先增加后降低，在提取时间为1.5 h时，多糖提取率达到最大，随后多糖提取率降低，但差异不显著。其原因可能是多糖在溶液中长时间处于高温环境，多糖的糖苷键遭到破坏，产生5−羟甲基糠醛，使多糖提取率降低[17]。因此，选择提取时间为1.5 h，此条件多糖提取率为19.73%。

图3 不同提取时间对滇黄精多糖提取率的影响Fig. 3 Effects of different extraction time on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

2.1.3 不同提取温度比对滇黄精多糖提取率的影响

由图4 可知，提取温度对滇黄精多糖提取率影响具有极显著差异（P<0.01）且影响较大。温度为50～80 ℃时，多糖提取率随温度的升高而增加，在提取温度为80 ℃时，提取率高达18.73%。可能是因为温度的升高有利于分子热运动加速[18]，从而提高多糖提取率，而温度超过80 ℃时，温度过高，多糖分子热不稳定，遭到破化，导致提取率降低[19]。因此，最佳提取温度选择为80 ℃。

图4 不同提取温度对滇黄精多糖提取率的影响Fig. 4 Effects of different extraction temperatures on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

2.2 响应面试验优化结果

以滇黄精多糖提取率作为响应值（Y），根据响应面法中的 Box−Behnken 实验原理运用 Design Expert 8.0.6进行设计，响应面分析方案及实验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

对响应面优化试验结果进行数据拟合分析，得到拟合全变量二次回归方程Y=−152.94349+0.62093X1+28.63261X2+3.48021X3−0.12444X1X2−0.00362198X1X3−0.18028X2X3−0.00266818X12−4.41070X22−0.018612X32。

对回归模型方差分析及模型系数进行检验，结果表明该模型的P<0.01，达到极显著水平，说明模型具有显著性。失拟值P>0.05，表明失拟项不显著，说明回归方程拟合程度较好，可以利用该模型对滇黄精中多糖提取进行分析和预测。R2＝0.9659，＝0.9220，证明模型实际值与预测值之间相关性好；变异系数值（3.6%）较低，表明了非常高的精度和实验值的良好可靠性。另外，模型中的1次项X1、X2，二次项X12、X22、X32和交互项X1X2、X1X3、X2X3的P值均<0.05，表明该试验滇黄精多糖的提取率受料液比和提取温度2个因素以及两两因素间的交互作用大的影响。由F值可知，各因素影响滇黄精多糖提取率的贡献大小为X3>X1>X2。

为了直观反应两两因素交互作用影响响应值变化强度，通过回归方程绘制响应面及其等高线图。结果如图5～7所示。

图5 料液比与提取时间对滇黄精多糖提取率影响的响应面和等高线Fig. 5 Response surface(a) and contour(b) of the effect of solid-liquid ratio and extraction time on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

响应面坡度和等高线密集程度可直观反应因素间交互作用对响应值影响程度的强弱[20]。响应面坡度越陡峭，说明交互作用对响应值的影响越大；等高线越密集呈椭圆形，因素间交互作用对响应值的影响越大，反之亦然[20]。由图5可知，X1与X2交互作用等高线图呈椭圆形，且响应面图坡度较陡，表明这两因素间交互作用对多糖提取率的影响极显著（P<0.01）；由图6可知，X1与X3交互作用等高线图似圆形，这两因素对多糖提取率影响显著（P<0.05）。由图7可知，X2与X3之间相互作用的响应面图坡度陡峭，等高线图椭圆形分布较密集，说明X2和X3两两交互作用对滇黄精多糖提取率影响显著（P< 0.05）。综合分析，两两交互作用影响大小为X1X2>X2X3>X1X3。

图6 料液比与提取温度对滇黄精多糖提取率影响的响应面和等高线Fig. 6 Response surface(c) and contour(d) of the effect of solid-liquid ratio and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

图7 提取时间与提取温度对滇黄精多糖提取率影响的响应面和等高线Fig. 7 Response surface(e) and contour(f) of the extraction time and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

2.3 滇黄精多糖纯化结果

通过采用Sevage试剂脱蛋白法和 DEAE纤维素离子交换树脂对提取物进行初步纯化，分别得到PKP、PKP−水和PKP−盐3种类型的多糖；纯度结果如图8所示；纯化后中性多糖纯度是水粗提物中总多糖纯度的 2.14倍，表明该方法有效可行，适于滇黄精多糖的纯化。

图8 滇黄精水提粗物、PKP、PKP−水和PKP−盐的纯度Fig. 8 The purity of crude polysaccharides extracted by water, PKP, PKP-water and PKP-salt

2.4 滇黄精多糖体外抗氧化结果

由图9可知，PKP、PKP−水、PKP−盐和VC都具有清除ABTS+·自由基的能力，在一定浓度范围内，ABTS+·自由基清除能力随多糖浓度的增加而提升，与样品浓度呈一定的量效关系。当浓度增加到 8 μg/mL后，VC上升的趋势减缓。经SPSS 20.0软件线性拟合，其清除 ABTS+·自由基的 SC50值分别为2.442 、0.825 、0.444 mg/mL，三者与 VC的清除能力排序为VC>PKP−盐>PKP−水>PKP表明滇黄精粗多糖粗提物和纯化后精制多糖具有一定的清除能力，但它的作用效果整体还是弱于VC（SC50=1.984 μg/mL）。

图9 PKP、PKP−水和PKP−盐和Vc的ABTS+·自由基清除效果Fig. 9 ABTS+· scavenging effect of PKP, PKP-water, PKP-salt and Vc

3 结论与讨论

在单因素实验基础上，通过Box−Behnken响应面实验优化了滇黄精多精的提取工艺，分析结果得出，最优提取工艺：料液比为1∶30 g/mL，提取时间为1.5 h，提取温度为80 ℃。在此条件下进行验性证性实验，滇黄精多糖提取率为20.70%与模型预测接近。通过抗氧化实验可知，PKP、PKP−水和PKP−盐对ABTS+·清除率的SC50值分别为2.442、0.825、 0.444 mg/mL，经DEAE纤维素离子交换树脂纯化后，滇黄精多糖抗氧化能力增强，并且酸性多糖抗氧化能力强于中性多糖，说明其可作为天然的抗氧化剂。

纯化后的多糖分为中性多糖和酸性多糖两大类，抗氧化活性得到提高，最高达5.55倍，但精制多糖的纯度较低，其中可能存在其他生物活性物质，例如滇黄精中含有黄酮类、多酚和皂苷类物质，也会产生一定的抗氧化活性，且几乎没有相关活性机制研究。因此，后期应进一步纯化滇黄精多糖，和探究其他各类化合物的抗氧化活性。然而，多糖结构的复杂程度较大，分子量较大，难以纯化分离得到单体多糖，国内外对其研究较少，因此对滇黄精多糖的深入研究还有待进一步开展，鉴于其广泛的生物活性，具有研究开发成各种新型保健产品的应用前景。