金茵利胆胶囊对肝内胆汁淤积大鼠PPARγ/NF-κB通路相关肝损伤影响*

肝内胆汁淤积引起的肝损伤可导致肝纤维化，而肝纤维化又是肝硬化以及早期肝癌的病理特征，因此阻止肝内胆汁淤积对于肝脏病变的防治具有重要意义。核因子-κB(NF-κB)是机体内一种转录调控因子，可调节免疫反应及炎症反应中多种细胞因子的表达

。多个研究发现，在发生胆汁淤积的肝组织中可检测到NF-κB的激活

。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)属于核受体超家族，研究证实它在糖、脂代谢以及炎症反应中均发挥重要作用

。研究报道，PPARγ对肝损伤具有一定调控作用，在该过程中PPARγ与NF-κB结合，抑制NF-κB信号通路及其下游炎性因子的表达，减轻炎性反应，从而发挥保护肝脏的作用

。金茵利胆胶囊具有疏肝利胆、清热利湿的效用。研究报道，金茵利胆可明显改善急性梗阻性化脓性胆管炎患者的肝功能

。目前关于金茵利胆胶囊对肝内胆汁淤积的治疗作用以及对PPARγ/NF-κB通路的影响尚未见有报道，本研究构建肝内胆汁淤积大鼠模型探究金茵利胆胶囊对其作用以及相关机制。

EPC项目出现主要的风险源就是工期。具体的施工过程中，工程的承包商需要选用倒排工序和正向组织的策略，对工程的整体进度计划进行设计，阶段进度计划的制定，要利用关键节点和工序与流程的有效控制，进行动态化管理控制，确保工程的进度。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠40只，体重(200±10)g，雌雄各半，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。

1.2 实验材料 金茵利胆胶囊购自陕西盘龙药业集团股份有限公司；熊去氧胆酸购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；α-萘异硫氰酸酯(alpha-naphthylisothi,ANIT)购自美国Sigma公司；Trizol RNA分离试剂、T-PER组织蛋白抽提试剂、Bradford蛋白定量试剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；总胆红素(TBil)试剂盒、总胆汁酸(TBA)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒购自中生北控生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒、白细胞介素-1β(IL-1β)试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司；PPARγ抗体、NF-κB p65抗体、β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；Bsep抗体、Ntcp抗体和Mrp2抗体购自上海碧云天生物技术有限公司。单通道移液器、高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；普通光学显微镜购自德国Leica公司；酶标仪、垂直板电泳槽、凝胶成像系统、蛋白转膜仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.4 蛋白质免疫印迹技术(Western Blot)检测PPARγ、NF-κB p65以及Bsep、Ntcp和Mrp2蛋白的表达 将大鼠肝脏组织从液氮中取出，剪碎，放入匀浆器，向组织碎块中滴加1 ml裂解液，置于冰上裂解10 min，随后使用匀浆器研磨至无组织碎片，将研磨得到的组织液收集至离心管中，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液经试剂盒测定蛋白浓度。将各组蛋白样本50 g与上样缓冲液混合均匀，沸水浴中处理5 min，加入到凝胶上样孔中，80 V电压约30 min可跑完浓缩胶，随后上调电压至120 V，约60 min可跑完分离胶，结束电泳。取出凝胶，切去多余部分，与硝酸纤维素(PVDF)膜一起叠放于两片滤纸中间，于蛋白转膜仪中200 mA转膜2.5 h。取PVDF膜用5%脱脂奶封闭液室温封闭1 h，洗涤3次后，加入相应的稀释(1∶1 000)一抗室温孵育2 h，洗涤后再加入稀释(1∶2 000)二抗室温孵育1 h，洗涤后显色，成像系统拍照，ImageJ软件分析条带灰度值。

1.3.1 动物造模及给药 40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、金茵利胆胶囊组、阳性药组，每组10只。模型组大鼠于第5天给予一次65 mg/kg ANIT灌胃

，其余时间均予以等体积生理盐水灌胃，每天1次，共计7 d。根据成人用药剂量换算，金茵利胆胶囊组大鼠给予0.54 g/kg灌胃，每天1次，连续7 d，并于第5天时增加一次0.1 g/kg ANIT灌胃。阳性药组大鼠给予熊去氧胆酸0.1 g/kg灌胃，每天1次，连续7 d，并于第5天时增加一次0.1 g/kg ANIT灌胃。正常组大鼠予以等体积生理盐水灌胃，每天1次，连续7 d。

1.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TBil、TBA、AST、ALT、TNF-α、IL-1β水平 对各组动物麻醉后进行腹主动脉取血，离心收取血清，按照ELISA检测试剂盒说明书操作，测定各组血清中TBil、TBA、AST、ALT、TNF-α、IL-1β水平。

通过对辅导员的职业生涯进行调研，发现在辅导员的职业生涯中，有的辅导员认为自己从事的辅导行业不是一个可以从事一辈子的行业，更有人认为这样的职业只是一个跳板[2]，无心提升自身的职业能力；而有的辅导员能够清晰岗位职责，明确自身定位，积极提升自身职业能力，进入职业化、专业化的发展阶段[3]；因此研究结果得出：在辅导员的职业生涯中，如果没有对自身职业的规划，则有转岗现象存在；若有明确的规划，则进入职业化、专业化的发展阶段，强者越强。

(3)长江体育产业带。长江经济带是我国经济布局“T”字形空间结构战略的主要发展轴。长江干流在江苏省流经南京、镇江、扬州、泰州、常州、无锡、苏州、南通等8个城市，《江苏省“十三五”旅游业发展规划》中提出构建“四带两圈一网”的省域旅游发展格局，长江旅游带是其中四带之一。江苏省体育小镇的建设，应以沿长江8市为聚集点，依托丰富多彩的长江景观带和大江风貌，科学利用长江岛洲，开发长江休闲体育旅游，打造长江体育产业带，培育一批高品质、有特色的体育小镇。

1.3.3 苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织病理学变化 取血后立即处死大鼠，取肝脏并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，部分储存于液氮备用，其余部分置于10%甲醛溶液中，经脱水、石蜡包埋后进行切片。取切片进行脱蜡，经100%、95%、90%、80%、70%乙醇处理后水洗，置于苏木素溶液中染色10 min，捞出水洗，使用1%盐酸酒精进行30 s分化处理，水洗，置于伊红溶液中染色2 min，水洗后脱水并透明，树胶封片，显微镜下观察。

吕振霖：太湖治理要跳出水利看水利。太湖蓝藻事件警示我们，加强河湖管理，维护河湖的健康生命，保障防洪安全和水资源的可持续利用，已经成为新时期江苏水利的一项突出而又紧迫的任务。“河长制”便是河湖管理中长效保障措施之一。江苏今后将继续按照《条例》有关规定和精神要求，认真执行“河长制”，为贯彻落实《条例》、治理太湖继续不懈努力。

2 结果

传统的校企合作模式是双方签订实习基地协议，在学生生产实习过程中并没有具体的企业对实践学生具体的指导任务和指导效果评价。要提高实践基地的效率，首要条件是制定科学合理的实践教学计划，通过校企双方共同努力，依据合作共赢的原则，使得实践教学达到预期效果。近年来，盐城工学院土木工程系已陆续建立二十余个校外实习基地，学生在企业实习期间，必须按照企业统一部署，由企业定人定岗进行管理，按照正式员工的工作要求，全过程参与工程建设，保证了实习效果。学校按照学生企业实习制度，由学院统一部署，实习教师专门负责，定期和不定期地到企业和相关工程项目中对学生的实习过程进行动态检查和评估，保证实习效果。

2.3 金茵利胆胶囊对肝内胆汁淤积大鼠胆汁代谢相关蛋白表达的影响 见图2、表2。

2.2 金茵利胆胶囊对肝内胆汁淤积大鼠肝组织病理学的影响 正常组大鼠肝组织呈现出正常的单行排列板状结构，肝细胞无坏死；模型组大鼠肝组织发生炎性细胞浸润，并伴有大面积的肝细胞坏死；相较于模型组，金茵利胆胶囊组和阳性药组大鼠肝组织无炎性细胞浸润，肝细胞坏死面积减小。见图1。

2.4 金茵利胆胶囊对肝内胆汁淤积大鼠肝组织PPARγ、NF-κB p65蛋白表达的影响 见图3、表3。

2.1 金茵利胆胶囊对肝内胆汁淤积大鼠肝功能的影响 见表1。

2.5 金茵利胆胶囊对肝内胆汁淤积大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影响 见表4。

3 讨论

肝内胆汁淤积可由肝内胆道病变或肝细胞损伤引起，胆酸盐过度蓄积于血清和肝脏中，持续的蓄积可导致肝纤维化甚至肝硬化或肝癌

。因此，寻求安全有效的肝内胆汁淤积治疗方法对于防治肝脏病变具有重要意义。

ANIT是一种动物肝毒性化学药物，可使胆管发生阻塞，胆汁淤积于肝脏，肝实质细胞坏死

。ANIT因其诱发的肝损伤无论是在生化指标上还是在病理改变上，均与人类肝内胆汁淤积性肝病的变化相似，所以常被用来建立肝内胆汁淤积动物模型。Xu等

研究报道，在ANIT制备的肝内胆汁淤积大鼠血清中可检测到ALT、AST、TBIL和TBA水平的升高，大鼠胆汁流动阻塞，发生肝脏损伤。向华夏等

研究报道，可在肝内胆汁淤积大鼠中检测到Bsep、Ntcp和Mrp2等胆酸代谢相关蛋白表达下调。在本研究中，灌服ANIT的模型组大鼠血清中肝功能指标TBil、TBA、AST、ALT水平明显升高，胆酸代谢相关蛋白Bsep、Ntcp和Mrp2蛋白表达显著降低，肝组织细胞出现水肿坏死、胆管周围可见炎细胞浸润及破坏，表明造模成功。金茵利胆胶囊具有抗炎、护肝、利胆、镇痛等作用，主要用于治疗慢性肝炎和急性黄疸型肝炎。陶立华等

研究报道，金茵利胆可降低TBil和AST水平，辅助治疗新生儿高胆红素血症。本研究结果显示，金茵利胆胶囊可使肝内胆汁淤积大鼠血清中TBil、TBA、AST、ALT水平显著降低，Bsep、Ntcp和Mrp2蛋白表达显著升高，减少肝组织中炎性细胞浸润和肝细胞坏死，提示金茵利胆胶囊可改善大鼠肝内胆汁淤积情况，对肝细胞具有保护作用。

NF-κB是一种核转录因子，静息状态下以无活性形式存在于胞浆，当细胞受到伤害性刺激时，NF-κB磷酸化被激活，进入细胞核结合相应靶基因，调节其转录。NF-κB是多个信号通路的交叉点，具有多种生物学活性，在机体的炎症反应和细胞增殖等过程中发挥重要的调控作用

。NF-κB p65是哺乳动物体内相对含量最丰富的NF-κB家族成员，也是NF-κB发挥功能的主要亚单位。Zhang等

研究证实，在妊娠肝内胆汁淤积症患者中可检测到NF-κB高表达和炎症反应。PPARγ对免疫反应和炎症反应具有负调控作用，它可与NF-κB结合，使NF-κB出核转运，从而拮抗NF-κB信号转导途径，减轻炎症反应，对机体起到保护作用。本研究结果显示，相较于正常组，模型组PPARγ表达显著降低，NF-κB p65表达以及TNF-α和IL-1β水平显著升高，与Zhang等

发现相符。本研究还发现，相较于模型组，金茵利胆胶囊组PPARγ表达显著升高，NF-κB p65表达以及TNF-α和IL-1β水平显著降低。Li等研究报道，在脓毒症模型小鼠中，上调PPAR-γ表达可抑制NF-κB的激活，降低炎性细胞因子(如TNF-α，IL-1β)的水平，从而抑制炎症反应，有效降低血清AST、ALT和肝脏指数，减轻肝脏病理损伤。另外，在急性肝损伤小鼠模型中亦发现上调PPAR-γ表达，可显著降低血清ALT、AST水平，抑制NF-κB通路活化，减少TNF-α和IL-1β的分泌。提示金茵利胆胶囊可能通过上调PPARγ表达，下调NF-κB表达，抑制炎症反应，保护肝内胆汁淤积大鼠肝脏。

综上所述，金茵利胆胶囊可能通过调控PPARγ/NF-κB通路，减轻肝内胆汁淤积大鼠肝损伤程度，为临床开发肝内胆汁淤积治疗药物提供科学依据和实验基础，但金茵利胆胶囊的临床效用还需要进行更多的临床验证。

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