基于Keap1/ARE通路探究氧化苦参碱对肝癌大鼠肝损伤的改善作用*

原发性肝癌简称肝癌，由肝细胞癌、肝内胆管细胞癌和混合型肝癌等组成，肝细胞癌约占90%

。有统计学研究表明，全球每年患肝癌的人数约为6万人，我国占一半，且随着社会压力的增大、环境的污染以及饮食结构的改变，其发病率逐年升高，且死亡率也居高不下，因此，早期诊断与合理治疗十分重要

。氧化苦参碱(OMT)是一种从槐属植物根部提取的生物碱成分，具有抗炎、抗纤维化、抗肿瘤以及防止心肌损伤等作用

。Chen等

研究发现OMT对肺癌、胃癌细胞诱导的血管内皮细胞增殖具有抑制作用，然而OMT在抑制肝癌细胞中是否发挥作用研究少见。Keap1/ARE信号通路是一种抗氧化、化学刺激的防御性转导通路，杨纯

表明Keap1/ARE信号通路诱导的蛋白表达可能参与了肝癌发生与病情转归。因此，本研究以二乙基亚硝胺法建立肝癌大鼠模型，并基于Keap1/ARE信号通路探究OMT干预后对肝癌的影响，为OMT治疗肝癌提供给实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SPF级SD大鼠75只，6周龄，体质量180～200 g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，动物生产许可号SCXK(沪)2019-0002。购买后置于23～25℃，湿度60%～65%，昼夜12 h交替适应性饲养7 d。

1.1.2 主要试剂与仪器 E2相关因子2(Nrf2)抑制剂Brusatol(美国MedChemExpress公司)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)、总胆汁酸(TBA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)ESISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)，兔抗鼠Nrf2、抗氧化反应元件(ARE)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)单抗(美国Abcam公司)，ST-360酶标仪(科华生物公司)。

新时期做好湿地自然保护区的建设工作，需要从我国湿地保护的现实情况出发，完善湿地保护管理机制，创新湿地保护策略，着力提高湿地自然保护区的稳定性与科学化水平，在加大技术与资金投入基础上开展湿地保护工作。

1.2.5 检测肝组织IL-1β、TNF-α水平 各组取4只大鼠肝组织，称重后，加入9倍体积的生理盐水进行匀浆，取上清，按照IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒说明书加样，用全自动酶标仪测定450 nm处的吸光(A)值，通过绘制标准曲线得出IL-1β、TNF-α的浓度。

30例参照组患者接受擦全身麻醉处理,具体方法为:实施麻醉前0.5h接受肌注0.5mg阿托品,同时监测患者生命体征,之后将上肢静脉通路开放,予以患者10ml/min乳酸林格液,静脉滴注,之后静脉滴注8mg维库溴胺、0.3mg/kg依托咪酯、5μg/kg芬太尼、0.04mg/kg咪达唑仑,滴注完成3min后对患者予以气管插管,连接麻醉呼吸机行机械通气。

2.3 肝组织病理学变化 空白组大鼠肝组织细胞形态正常，排列整齐。模型组大鼠肝组织细胞排列紊乱，明显肿胀，大量炎细胞浸润。OMT组大鼠肝组织细胞排列较整齐，细胞有点状坏死，损伤程度明显改善。Brusatol组肝细胞肿胀、坏死、排列紊乱，炎细胞浸润。OMT+Bru组大鼠肝组织细胞仍肿胀明显，部分肝细胞排列有序，少量炎细胞侵润。见图1。

1.2.2 干预方法 在造模结束，即第17周开始，OMT+Bru组大鼠腹腔注射60 mg/kg OMT与2 mg/kg Nrf2抑制剂Brusatol(溶于1% DMSO中)，OMT组大鼠腹腔注射60 mg/kg OMT与等量1% DMSO，Brusatol组大鼠腹腔注射2 mg/kg Nrf2抑制剂Brusatol与等量1% DMSO，空白组大鼠注射等量1% DMSO和生理盐水。OMT与生理盐水每天注射1次，Brusatol和含1% DMSO的生理盐水2 d注射1次，共注射20 d。

因此本文提出UAV+RFID技术在制品信息采集的无人机三维路径规划问题，旨在求解UAV+RFID技术在制品库存信息采集的最优化路径，确保在规避障碍物的前提下实现在制品库存的信息采集。

1.2.3 标本采集 干预20 d后，各组大鼠用3%戊巴比妥按照40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹腔静脉取血4 ml，3 500 r/min离心8 min，取上层血清-20℃保存。所有大鼠全部处死，分离肝组织，一部分-80℃保存，一部分用4%中性甲醛固定。

2.4.1 家庭支持:家是一个人最坚实的依靠,家庭的支持对于患者的治疗而言具有重要的意义,具体表现在家人的态度可直接影响到患者的心情以及治疗的信心,因此,采取恰当的方式表达爱与关怀。作为患者的配偶,关键在于不嫌弃、不抱怨、不悲观,尽量保持乐观积极的心态,并将这种心态传递给患者,让其能以积极的心态接受造口。

1.2.4 ELISA法检测血清ALT、AST、TBil、TBA 取-20℃保存的大鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书加样，用全自动酶标仪测定450 nm处的吸光(A)值，通过绘制标准曲线得出ALT、AST、TBil、TBA浓度。

1.2 方法

飞速发展的互联网时代带给高职院校学生新的就业机会同时也带来一系列挑战，新时代的到来意味着人才竞争更加激烈，各行各业要求更加精细化，如在网上购买一台电脑，需要技术人员维护平台、客服沟通、厂家发货、物流运输、快递员精准送货、售后服务等一系列人才，随着电商的发展岗位也日新月异，社会对人才的培育需要有较强的业务素质和健康的心理素质，较强的团队协作精神和严谨的工作作风等。

1.2.6 HE染色观察肝组织病理学变化 4%中性甲醛中固定的肝组织梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，厚度4 μm，行常规HE染色。封片后置于显微镜下观察肝组织病理学形态。

2.1 各组大鼠血清ALT、AST、TBil、TBA水平 见表1。

1.2.8 Western Blot法检测肝组织Nrf2、Keap1、ARE蛋白相对表达水平 -80℃保存的肝组织100 mg，研磨后加蛋白抽提裂解液，冰上裂解，离心取上清进行蛋白定量，100℃水浴使蛋白变性，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，洗膜后加入1∶1 000稀释的Nrf2、Keap1、ARE一抗，4℃孵育过夜，洗膜后加入1∶4 000辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，洗膜后加入ECL发光液显影，采用Image J软件分析图像，以β-actin为内参，Nrf2、Keap1、ARE蛋白相对表达水平以各蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值表示。

2.2 各组大鼠肝组织IL-1β、TNF-α水平 见表2。

2 结果

1.2.7 TUNEL染色检测大鼠肝癌细胞凋亡情况 石蜡包埋的肝组织切片进行脱蜡，0.3% H

O

浸泡5 min；PBS清洗5 min，2次；加入蛋白酶K 37℃孵育30 min；PBS清洗5 min，3次；加入Tunel反应液37℃孵育60 min；PBS清洗5 min，3次；滴加3% BSA室温孵育20 min；PBS清洗5 min，3次；POD转换液37℃湿盒孵育30 min，PBS清洗5 min；DAB显色5 min，苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜下观察肝癌组织细胞凋亡情况，每张切片选取5个视野，计算凋亡率(凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%)。

加强型切口翅片是在普通切口型翅片的基础上局部改动优化所得，关键要点在凸凹刀齿的配合上，既要形成加强筋起到加强作用，又要使错位在铝材的可延伸范围内，不至于形成新的切口，反而降低了翅片的强度[5-6]，如图5和图6所示关键控制点。

1.2.1 大鼠肝癌模型建立及分组 除空白组外，实验大鼠腹腔注射二乙基亚硝胺50 mg/kg，空白组大鼠注射等量生理盐水，每周1次，连续注射16周。预实验中经HE染色光镜下观察，发现注射二乙基亚硝胺后实验大鼠肝组织细胞有不同程度的坏死、变形，纤维组织增生，癌变肝细胞呈灶状、巢状或条索装分布，证实造模成功。造模成功的大鼠随机分为空白组、模型组、OMT组、Brusatol组、OMT+Bru组，每组15只。

2.4 各组大鼠肝癌细胞凋亡情况 模型组、OMT组、Brusatol组、OMT+Bru组大鼠肝癌细胞凋亡率分别为：(9.44±1.86)%、(31.46±2.69)%、(5.23±1.32)%、(18.79±2.12)%，组间比较差异有统计学意义(

<0.05)。见图2。

2.5 各组大鼠肝组织Nrf2、Keap1、ARE蛋白相对表达水平 见表3，图3。

3 讨论

目前，肝癌的致病原因还在探索中，初步认为肝癌是基因和环境因素共同导致的结果。肝癌早期无特异性症状，中晚期症状较多，常表现为肝区疼痛、腹胀、乏力、进行性肝肿大或上腹部包块等，部分患者出现黄疸、腹泻、低热、上消化道出血等

。OMT是从西北地区特有的苦参根中提取的豆科槐属类生物碱，具有止痛抗炎、抗内毒素效应及调节免疫等多方面的药理作用，同时OMT对葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎、慢性乙型肝炎、实验性重症急性胰腺炎起到不同程度的治疗效果

。因此，本研究分析了OMT对大鼠肝癌的抑制作用以及对肝损伤的影响。

转氨酶是人体代谢过程中必不可少的催化剂，主要存在于肝细胞内。当肝细胞损伤时，转氨酶释放到血液里，使血清转氨酶升高。ALT是转氨酶主要检测项目，可敏感地监测到肝脏是否受到损害

。AST主要存在于肝细胞线粒体内，当肝脏发生严重坏死或破坏时，血清中AST浓度可异常升高

。TBil反映肝脏分泌和排泄功能

，健康人的外周血血清TBA含量极微，当肝细胞损害或肝内、外阻塞时，TBA表现为异常升高

。IL-1β、TNF-α均为促炎因子，TNF-α在多种肝损伤模型及人类肝病中起着关键作用。研究表明，TNF-α与酒精性肝炎、病毒性肝炎、爆发性肝衰竭有关，TNF-α水平显著升高

。本研究中OMT组大鼠血清ALT、AST、TBil、TBA、IL-1β、TNF-α水平较肝癌模型组降低，提示OMT减轻肝癌大鼠肝损伤，降低炎症反应。房伟等

研究表明OMT能够抑制人胃癌BGC-823细胞生长，促进胃癌细胞凋亡。孙超群等

研究发现OMT可以抑制人膀胱癌T24细胞增殖，促进其凋亡。本研究中OMT组大鼠肝组织病理损伤明显改善，肝癌细胞凋亡率明显高于模型组，提示OMT通过促进肝癌细胞凋亡抑制大鼠肝癌，保护肝组织。

Keap1-Nrf2/ARE信号通路是迄今发现的最重要抗氧化通路，参与体内氧化应激反应。Nrf2是活力最强的一种转录调节因子，发生激活障碍可导致细胞对应激源的敏感性升高。ARE是特异性DNA-启动因子结合序列，可与Nrf2特异性结合，诱导相关抗氧化蛋白生成。Keap1是Nrf2调节的关键因子，正常情况下与Nrf2呈结合状态，受到自由基刺激后解离，致Nrf2活化。Keap1-Nrf2/ARE信号通路对某些肿瘤细胞具有抑制作用，通过激活Nrf2的活性，促进其核异位来诱导相关保护蛋白抵抗正常细胞发生恶变的能力，同时提高肿瘤细胞中某些促凋亡蛋白的表达进而促使其发生凋亡

。田崇梅等

发现亚硒酸钠通过抑制人肺腺癌A549细胞增殖，诱导细胞凋亡，调节细胞内的氧化应激反应，调控Keap1/Nrf2/ARE抗氧化信号通路，从而促进肿瘤细胞凋亡。常景芝等

发现微小RNA-141可能通过靶向负调控Keap1激活Nrf2/ARE信号通路，诱导抗氧化酶的表达，以降低细胞氧化应激水平，从而抑制乳腺癌细胞的活力。本研究中与模型组比较，OMT组、OMT+Bru组Nrf2、ARE上调，Keap1下调，Nrf2抑制剂Brusatol组Nrf2、ARE下调，Keap1上调，提示OMT可能通过促进肝癌组织中Nrf2活化，激活下游ARE信号，诱导相关抗氧化蛋白生成，从而减轻肝损伤，发挥肝脏保护作用。

综上所述，OMT对大鼠肝癌具有抑制作用，能够改善肝损伤，可能是通过激活Keap1/ARE通路发挥作用，为临床肝癌治疗提供理论支持。

[1] Liu Z,Jiang Y,Yuan H,

.The trends in incidence of primary liver cancer caused by specific etiologies: results from the global burden of disease study 2016 and implications for liver cancer prevention[J].J Hepatol,2019,70(4):674-683.

[2] Chen Y,E CY,Gong ZW,

.Chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy for liver cancer [J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2018,17(4):301-309.

[3] Xie W,Zhang Y,Zhang S,

.Oxymatrine enhanced anti-tumor effects of Bevacizumab against triple-negative breast cancer via abating Wnt/β-Catenin signaling pathway [J].Am J Cancer Res,2019,9(8):1796-1814.

[4] Chen K,Zhu P,Ye J,

.Oxymatrine inhibits the migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells by reducing the activity of MMP-2/-9 via regulating p38 signaling pathway [J].J Cancer,2019,10(22):5397-5403.

[5] 杨纯.Gankyrin正反馈调控Nrf2在肝细胞癌中发挥抗氧化作用[D].上海：第二军医大学,2015:1-97.

[6] Maucort-Boulch D,de Martel C,Franceschi S,

.Fraction and incidence of liver cancer attributable to hepatitis B and C viruses worldwide [J].Int J Cancer,2018,142(12):2471-2477.

[7] Shi HJ,Zhou H,Ma AL,

.Oxymatrine therapy inhibited epidermal cell proliferation and apoptosis in severe plaque psoriasis [J].Br J Dermatol,2019,181(5):1028-1037.

[8] Li X,Sun J,Xu Q,

.Oxymatrine inhibits colorectal cancer metastasis via attenuating PKM2-mediated aerobic glycolysis [J].Cancer Manag Res,2020,12:9503-9513.

[9] 张效敏,芦瑞萍,海秀玲,等.浅析血清丙氨酸氨基转移酶水平与肝脏病理改变的关系[J].医药前沿,2019,9(11):32-34.

[10] Kang M,Yu J,Sung HH,

.Prognostic impact of the pretreatment aspartate transaminase/alanine transaminase ratio in patients treated with first-line systemic tyrosine kinase inhibitor therapy for metastatic renal cell carcinoma [J].Int J Urol,2018,25(6):596-603.

[11] Fan Z,Chen L,Li J,

.Clinical features of COVID-19-related liver functional abnormality[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2020,18(7):1561-1566.

[12] 胡掌朝.血清PCT,hs-CRP及TBA在慢性病毒性肝炎诊治中的作用分析[J].临床研究,2020,28(9):109-110.

[13] 薛立芝,张思泉.慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平及临床意义[J].中国现代医学杂志,2020,30(12):119-122.

[14] 房伟,马世勋,马云涛,等.氧化苦参碱诱导胃癌BGC-823细胞发生caspase-12依赖性内质网应激凋亡的机制研究[J].中国普外基础与临床杂志,2019,26(4)：399-404.

[15] 孙超群,杨树立,陈桂平,等.氧化苦参碱通过PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路对人膀胱癌T24细胞增殖,凋亡的影响研究[J].新中医,2019,51(9):19-22.

[16] Serafini MM,Catanzaro M,Fagiani F,

.Modulation of Keap1/Nrf2/ARE signaling pathway by curcuma-and garlic-derived hybri-ds[J].Front Pharmacol,2020,10:1597.

[17] 田崇梅,夏道宗,邢梦雨,等.亚硒酸钠通过Keap1/Nrf2/ARE信号通路诱导人肺腺癌A549细胞凋亡[J]．中国药理学通报,2019,35(2):181-186.

[18] 常景芝,陈剑,芦琨,等.MicroRNA-141靶向Keap1调控Nrf2/ARE信号通路对乳腺癌T47D细胞活力的影响[J].中国病理生理杂志,2018,34(7):1245-1249.