诃子对大鼠血清代谢产物的影响研究*

毕力格，乌日汉，丽 丽，陈玉花，孟香花，宝乐尔，韩晓静，肖田梅，白梅荣

(内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028000)

诃子为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.或绒毛诃子TerminaliachebulaRetz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果实。秋、冬二季果实成熟时采收。蒙古名为阿茹日，异名为额莫音·芒来、浩日音·达日嘎，味涩，性平，具有调节赫依、希日、巴达干失调，解毒，调元等功能。主治赫依病，希日病，巴达干病，赫依、希日、巴达干合并症和聚合症，各种毒症等[1]。现代研究证明，诃子还有止泻、收敛降火、利咽等功效，主治泻久痢、便血脱肛、肺虚喘咳、咽痛、音哑等症状[2-3]。在蒙药药性理论的指导下，诃子主要用与中毒解救和调元，在98%的常用含有毒药味的蒙药复方中诃子均发挥着解毒和调元作用，两千多年的蒙医临床实践也证明了复方组成的合理性和可行性。因此，诃子被誉为“药中之王”和“镇毒之王”的美名。目前对诃子的研究主要集中于诃子化学成分、现代药理作用及基于代谢组学的脑损伤保护机制及草乌解毒机制等研究，但未见诃子单味药代谢组学的研究报道。因此，本研究用LC-MS技术，分析蒙药诃子对大鼠小分子代谢物的改变情况，为探讨诃子调节赫依、希日、巴达干失调，解毒和调元功效的现代化机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物 SD雄性大鼠，SPF级，体重为(200±20)g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供(SCXK(辽)2015-0001)。

1.2 药品与试剂 实验用诃子药材是使君子科植物诃子成熟果实，由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供，由蒙医药学院包桂花教授鉴定；纯化水(屈臣氏集团有限公司)，质谱乙腈(美国Thermo Fisher Scientific公司)，甲酸(Sigma-Aldrich公司)。

1.3 仪器 质谱仪MASS(TripleTOF5600+，AB SCIEXTM)；台式高速冷冻离心机(Mikro 220R，Hettich)；罗氏全自动生化分析仪(cobas c 311)；移液器(Eppendorf N13462C，德国Eppendorf公司)；粉碎研磨仪(TL-48R，上海万柏生物科技有限公司)；漩涡振荡器(QL-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；色谱UHPLC(Nexera UHPLC LC-30A，岛津SHIMADZU)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及取材 取雄性大鼠16只，按体重随机分为正常组、给药组诃子1.2857 g/kg(临床等效量)、每组8只。从实验第1 d开始，给药组灌胃相应的药物溶液，每日1次，连续21d给药，正常组灌胃等量生理盐水。末次给药后，经 2% 戊巴比妥钠(50 mg· kg-1)腹腔注射麻醉，采用腹主动脉取血，在室温下 静置半小时后放入3 000 r·min-1离心 10 min，取上清液，同时采集同一部位肝、肾组织置冻存管，置于-80 ℃ 冰箱中保存待测。

1.4.2 代谢物提取 血清样本于4℃解冻后，取100 μL加入300 μL甲醇，震荡提取于12000 rpm，4℃下离心10 min，取上清液进样10 μL，用UPLC-MS检测。

1.4.3 UPLC-MS检测 采用Waters BEH HILIC 色谱柱(100×2.1 mm，1.7 μm)。流动相A(0.1%甲酸水，乙酸铵)和B(乙腈)，柱温35℃，流速0.3 mL/min，进样量10 μL。洗脱梯度：95%～50% B，0～16 min；50% B，16～20 min；50%～95% B，20～21 min；95% B，21～22.5 min。

质谱参数条件：采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。ESI源条件如下：离子源 Gas1：50，离子源 Gas2：50，气帘气压力(CUR)：25，界面加热温度：500℃(正离子)和450℃(负离子)，离子喷雾电压浮动(ISVF)5500 V(正离子)和4400 V(负离子)，TOF质量扫描范围：100～1200 Da，产物离子扫描范围：50～1000 Da，TOF MS 扫描累积时间0.2 s，产物离子扫描累积时间0.01 s，二级质谱采用information dependent acquisition(IDA)获得，并采用high sensitivity模式，去簇电压(DP)：±60 V，碰撞能量：35±15 eV。

1.4.4 数据处理 应用SPSS 22.0进行统计分析。采用t检验、秩和检验、单因素方差分析分别进行组间比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

利用Analysis Base File Converter软件将获得的原始数据转换成ABF格式，再导入MS-DIAL 4.10软件进行预处理。使用MassBank，Respect，GNPS数据库进行比对。分析各组血清样本采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判别分析法(OPLS-DA)。筛选VIP≥1及FC>=1.5和P<=0.05作为差异代谢物。再使用MetaboAnalyst 4.0分析代谢通路。

2 结果

2.1 PCA分析结果 PCA通过主要新变量对各组数据进行归类，去除重复性差和异常样本，可观察样品的聚集、离散程度。如图1、所示，正常组(8)与诃子组(7)的大鼠肝代谢物呈现分离趋势，说明代谢物具有一定的差异。利用MetaboAnalyst软件进行聚类分析，以热图的聚类结果分析组间差异，颜色深浅表示代谢物水平，红色为升高、蓝色为降低。如图2所示，正常组与诃子组的代谢物相对丰度呈有明显差异。表明，诃子可使大鼠肾代谢物产生一定变化。

图1 血清代谢物 PCA

图2 血清代谢物热图

2.2 OPLS-DA结果 OPLS-DA作为一种有监督的分析方法，能够筛选出差异代谢物。如图3所示，正常组大鼠血清代谢物与诃子组完全分离，说明代谢物谱有显著差异。通过参数检验进行OPLS-DA 模型验证，具有良好的准确率和预测率(参数R2Y和Q2均大于0.5)。

图3 血清OPLS-DA的S-plot图

2.3 差异代谢物的筛选 血清差异代谢物的筛选：为寻找潜在差异代谢物，采用OPLS-DA中VIP≥1和P<0.05，且fold change>1.5(或<0.5)的标准筛选，通过MassBank，Respect，GNPS数据库进行检索分析。诃子组血清样本中筛出2个差异代谢物。与正常组比较，诃子组谷氨酰胺、溶血性磷脂酰胆碱明显上升，见表1。

表1 血清差异代谢物鉴定

2.4 差异代谢物通路分析 将筛选出的差异代谢物导入MBRole 2.0进行通路富集分析。血清差异代谢物涉及ABC转运蛋白、嘧啶代谢、氨基酸的生物合成、嘌呤代谢等通路，见图4。

图4 血清样品代谢通路气泡图

3 讨论

从血清OPLS-DA的S-plot图中能看出，给药组和正常组数据点能分开，不重叠，通过血清差异代谢物的筛选发现供能物质谷氨酰胺、溶血磷脂酰胆碱含量明显增高。

谷氨酰胺主要在大脑组织中生成，骨骼肌，心肌等。是体内解除氨毒的重要方式，体内谷氨酰胺合成给蛋白质提供重要原料[3]；体内储存的氨、经过血液运输至肝转运利用、进一步到肾及小肠等组织中代谢。是合成嘌呤、嘧啶等含氮化合物的重要原料，改善心脏功能，缓解急性心肌梗死症状[4]。本实验结果表明，诃子可提高机体解除氨毒功能，并对改善心脏功能及急性心肌梗死等方面也有一定的促进作用。

溶血磷脂酰胆碱(LPC18：2)是磷脂的一种，具有多种生理功能，与糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常等代谢性疾病和心血管疾病密切相关。LPC18∶2主要在肝脏代谢，在肝脏疾病和药物引起的肝毒性血清中LPC 16∶0、LPC18∶0、LPC18∶2、LPC 18∶3或LPC18∶1等多种LPCs的浓度均明显降低[5-9]。大量研究推测，LPC18∶2将能成为肝脏疾病和肝毒性损伤的生物标志物，将对肝脏疾病和药物肝毒性的诊断与治疗发挥重要作用。另外，较高水平的 LPC18∶2反映其机体血浆脂质的转运能力。LPC18∶2含量下降可抑制外周游离胆固醇的酯化，被载脂蛋白携带最终转运回肝脏代谢等脂质转运能力受限，增加其血浆胆固醇含量，使肝脏功能受损进而其脂肪变性[10-13]。本研究结果显示，LPC18∶2含量的提高，可防止肝脏脂肪变性、肝硬化、酒精性肝损伤、非酒精性肝损伤等病理变化。同时可推测诃子对多种代谢性疾病和心血管疾病均有一定的保护作用。该实验结果与诃子在蒙药药性理论指导下所产生的广泛解毒和调元作用相符合。诃子被誉为“药中之王”、“镇毒之王”美名具有一定的科学性和合理性。因此，诃子在含有毒蒙药复方发挥其神奇临床疗效中具有重要的不可替代的角色。