定志小丸有效成分对阿尔兹海默病转基因模型小鼠的氧化应激、炎症和自噬因子的作用研究

钟晓琴，宁振求,2，王 凯,2，邓敏贞,2*

（1.广州中医药大学，广州 510006；2.广东省中医院/广州中医药大学第二附属医院/广东省中医药科学院，广州 510120）

阿尔兹海默病是一种常见的神经退行性疾病，其临床表现是学习障碍、记忆力下降等认知能力损伤[1]。研究报道淀粉样蛋白前体蛋白（APP）水解后会诱发β 淀粉样蛋白（Aβ）增加，其异常沉积会引起神经元损伤和神经炎症等病理现象[2]。此外，神经炎症的加剧也会诱发氧化应激的发生发展[3]。在阿尔兹海默病的神经元中Aβ 会损害自噬小泡的运输过程，造成阿尔兹海默病相关的自噬病理现象[4]。定志小丸是治疗神经系统疾病的经典方剂，本课题组前期研究发现其成分对血管性痴呆小鼠具有缓解海马神经元损伤的作用[5]。因此，本实验研究定志小丸成分对阿尔兹海默病模型小鼠的作用及其机制。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料 70 只APP/PS1 雄性小鼠（SPF 级，5月龄）和10 只C57BL/6 雄性小鼠（SPF 级，5 月龄）购于广州中医药大学实验动物中心，动物使用许可证号是SYXK（粤）2018-0034。本实验经过广东省中医院动物伦理委员会审核通过，其伦理编号是2020001。实验动物在日照时长12 h，自由饮水，温度（22±2）℃，湿度（55±5）%的SPF 级环境中适应饲养3 d 后再进行实验。人参皂苷Rb3 和β-细辛醚（批号：wkq18020701 和wkq18042602，纯度≥98%，四川省维克奇生物技术有限公司）；多奈哌齐片（批号：1806077，每片10 mg，中国卫材药业有限公司）；Akt 抑制剂（LY294002，货号：S1105，美国Selleck 公司）；自噬抑制剂（3-methyladenine，货号：S2767，美国selleck 公司）；单胺氧化酶（MAO）、活性氧（ROS）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHDG）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和Beclin-1 ELISA 试剂盒（批号均是01/2021，上海酶联生物科技有限公司）；苏木素伊红染色试剂盒（货号：C0105M，上海碧云天生物技术有限公司）。多功能染色机（ST5020，上海徕卡仪器有限公司）；基础型分散机（IKA T10，德国IKA 公司）；高速冷冻离心机（5804R，德国Eppendorf 公司）；电子天平（ME403，上海梅特勒-托利多国际贸易有限公司]；全波长酶标仪（Biotek-EON，美国伯腾仪器有限公司）。

1.2 实验分组与给药剂量 将转基因小鼠随机分为6组：模型组、人参皂苷Rb3 组（15 mg/kg，灌胃），β-细辛醚组（45 mg/kg，灌胃），联合组（人参皂苷Rb3 15 mg/kg 加β-细辛醚45 mg/kg，灌胃），多奈哌齐组（3 mg/kg，灌胃）、Akt 抑制剂组（25mg/kg，腹腔注射给药）和自噬抑制剂组（30 mg/kg，灌胃），并设正常组（C57BL/6 小鼠），每组10 只。除模型组和正常组给予等体积生理盐水，各组给药30 d，每天1 次。

1.3 检测指标

1.3.1 ELISA 检测小鼠皮质组织MAO、ROS、8-OHDG、TNF-α、IL-6、IL-10 和Beclin-1 的含量 各组小鼠给药结束后，经10%水合氯醛（350 mg/kg，灌胃）麻醉，用生理盐水心脏灌注后，迅速在冰台上开颅取脑，分离皮质组织，保存在-80 ℃冰箱待用。把组织按1:9（重量g : 体积mL）比例加入生理盐水，电动匀浆后4 ℃ 10 000 r/min 离心10 min，取组织上清液，按试剂盒说明书操作，用酶标仪检测对应指标的吸光度。

1.3.2 HE 染色观察小鼠皮质组织形态 把各组小鼠皮质组织用4%水合氯醛固定24 h，按常规脱水包埋操作，按4 μm 厚度切片，把各组玻片置自动染色机进行HE 染色处理，中性树脂封片，置光学显微镜中观察组织病理状态。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件，所有数据用均数±标准差（）表示，两两比较采用单因素方差分析检验。

2 实验结果

2.1 各组小鼠氧化应激相关因子MAO、ROS 和8-OHDG 的含量变化 从图1 可知，与正常组比较，模型组的MAO、ROS 和8-OHDG 含 量增加（P＜0.01）。与模型组比较，人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组、多奈哌齐组和自噬抑制剂组的MAO、ROS、8-OHDG 含量减少（P＜0.01），而Akt 抑制剂组的MAO、ROS 和8-OHDG 含量增加（P＜0.01）。与多奈哌齐组比较，人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组和Akt 抑制剂组的MAO、ROS、8-OHDG 含量增加（P＜0.01），而自噬抑制剂组的MAO、ROS、8-OHDG 含量减少（P＜0.01）。与自噬抑制剂组比较，人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组和Akt 抑制剂组的MAO、ROS、8-OHDG 含量增加（P＜0.01）。

图1 各组小鼠皮质中MAO、ROS 和8-OHDG 的含量变化

2.2 各组小鼠炎症相关因子TNF-α、IL-6 和IL-10 的含量变化 从图2 可知，与正常组比较，模型组的TNF-α 和IL-6含量增加（P＜0.01），IL-10含量减少（P＜0.01）。与模型组比较，人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组、多奈哌齐组和自噬抑制剂组的TNF-α 和IL-6 含量减少（P＜0.01），IL-10 含量增加（P＜0.01），而Akt 抑制剂组的TNF-α 和IL-6 含量增加（P＜0.01），IL-10 含量减少（P＜0.01）。与多奈哌齐组比较，人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组和Akt 抑制剂组的TNF-α 和IL-6 含量增加（P＜0.01），IL-10 含量减少（P＜0.01），而自噬抑制剂组的TNF-α 和IL-6 含量减少（P＜0.01），IL-10 的含量增加（P＜0.01）。与自噬抑制剂组比较，人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组和Akt 抑制剂组的TNF-α 和IL-6 的含量增加（P＜0.01），IL-10 含量减少（P＜0.01）。

图2 各组小鼠皮质中TNF-α、IL-6 和IL-10 的含量变化

2.3 各组小鼠的自噬相关因子Beclin-1 的含量变化 从图3 可知，与正常组比较，模型组的Beclin-1含量增加（P＜0.01）。与模型组比较，人参皂苷Rb3组、β-细辛醚组、联合组、多奈哌齐组和自噬抑制剂组的Beclin-1 的含量减少（P＜0.01），而Akt 抑制剂组的Beclin-1 的含量增加（P＜0.01）。与多奈哌齐组比较，人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组和Akt 抑制剂组的Beclin-1 含量增加（P＜0.01），而自噬抑制剂组的Beclin-1 含量减少（P＜0.01）。与自噬抑制剂组比较，人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组和Akt 抑制剂组的Beclin-1 含量增加（P＜0.01）。

图3 各组小鼠皮质中Beclin-1 的含量变化

2.4 各组小鼠的皮质组织病理学情况 如图4 所示，正常组的皮质组织细胞数量较多，排列整齐，细胞致密，而模型组和Akt 抑制剂组的细胞间隙较大，细胞核数量较少、核固缩明显，细胞排列较为稀疏和杂乱。人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组、多奈哌齐组和自噬抑制剂组的细胞间隙不太明显，细胞核固缩有所缓解。

图4 各组小鼠皮质的组织病理学情况（×200，标尺是100 μm）

3 讨论

阿尔兹海默病是多因素诱发的复杂的神经退行性疾病，氧化应激反应、神经炎症反应、自噬障碍等是导致阿尔兹海默病产生与发展的重要因素[6]。研究发现自噬障碍会造成Aβ 的异常堆积，Aβ 还可通过产生活性氧和激活小胶质细胞，加重氧化应激反应和炎症反应，加剧神经元功能紊乱，导致神经元的发生病理损伤[7]。由于阿尔兹海默病病机多样性且尚不明确，传统用来治疗阿尔兹海默病的药物（多奈哌齐、美金刚等）虽可以减缓阿尔兹海默病病程,以对症治疗为原则，长期服用会有明显毒副作用[8-9]。中药具有多靶点且不良反应小的优势[10]，而阿尔兹海默病的临床表现属于中医“呆症”的范畴，可选用源于《备急千金要方》的益智方剂定志小丸，其具有化痰开窍、益智定志之功效[11]。本课题组前期研究发现定志小丸中人参皂苷Rb3 联合β-细辛醚对血管性痴呆模型小鼠具有缓解神经元损伤的作用[5]，但其机制尚不明确。因此，本实验主要研究定志小丸成分对阿尔兹海默病模型小鼠的作用及其作用机制。

抗氧化能力不能完全清除体内氧自由基就会激活氧化应激反应，ROS 可以攻击生物膜使膜脂过氧化，过氧化产物会损伤生物膜的结构和功能，严重者可以导致细胞的死亡[12]。8-OHDG 是DNA 中鸟嘌呤碱基第8 位碳原子被活性氧自由基攻击而产生的一种氧化性加合物[13]。MAO 是存在于神经元、胶质细胞等机体细胞中的一类催化酶，既能够催化单胺类递质的代谢，使单胺类神经递质减少，也能增加氧自由基的生成，加剧神经功能损害[14]。本实验结果表示，阿尔兹海默病模型小鼠的ROS、8-OHDG 和MAO 的含量比正常组小鼠都增加，符合阿尔兹海默病病理表现。经过人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组和自噬抑制剂组的干预后，其氧化应激相关因子都有所减少，提示定志小丸成分对阿尔兹海默病模型小鼠的氧化应激具有一定的抑制作用。

阿尔兹海默病发生神经炎症的关键证据是阿尔兹海默病大脑中促炎细胞因子负荷增加[15]。脑组织炎症反应，释放TNF-α 等炎性因子损伤大脑神经元，导致认知功能下降[16]。IL-6 属于促炎因子，IL-10 属于内源性的抗炎介质[17]。通过本实验结果可知，与正常组比较，模型组的TNF-α 和IL-6 含量增加，IL-10 含量减少，提示阿尔兹海默病小鼠发生炎症反应。给予人参皂苷Rb3、β-细辛醚和自噬抑制剂的阿尔兹海默病模型小鼠，TNF-α 和IL-6 含量减少，IL-10 含量增加，这说明各给药组都具有一定抗炎作用。

Beclin-1 是启动自噬小体的关键因子[18]。研究发现自噬泡中富含淀粉样前体蛋白、Aβ 及γ-分泌酶，诱导自噬可引起 Aβ 增多[19]。本实验结果发现，阿尔兹海默病模型小鼠的Beclin-1 表达较高，提示阿尔兹海默病小鼠处于自噬激活状态，经过人参皂苷Rb3 组、β-细辛醚组、联合组和自噬抑制剂组干预的模型小鼠，它们的Beclin-1 表达都显著减少，这说明定志小丸成分对阿尔兹海默病模型小鼠具有一定抑制自噬的作用。PI3K/Akt/mTOR 信号通路参与了细胞生理过程（如生长、增殖等）的调控[20]。在本实验结果也发现，自噬抑制剂组的抗氧化和抗炎也较为显著，而Akt 抑制剂组的促炎和激活氧化反应尤为突出，这提示定志小丸成分可能具有激活Akt 来减缓神经元损伤和自噬的作用。

综上所述，定志小丸有效成分对阿尔兹海默病模型小鼠具有保护神经元的作用，表现为抗氧化应激和抑制神经炎症，其机制可能是通过激活Akt 通路来降低细胞自噬的激活程度。