夏枯草三萜类提取物联合Survivin-siRNA对食管癌Eca-109细胞抑制作用研究

郑学芝 徐秋玲 郭 冉 孙 健 王文婷

牡丹江医学院生理学教研室，黑龙江牡丹江 157011

中药夏枯草具有散结、明目、清火、消肿、抗肿瘤等作用，所含化学成分包括三萜类（熊果酸、齐墩果酸）、黄酮类、香豆素类、有机酸类、糖类、挥发油类等。其中夏枯草提取物的抗肿瘤作用表现在抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡、诱导分化、逆转肿瘤耐药、抑制新生血管生成、抗突变等多方面。但传统中药抗肿瘤具有药物生物利用度低、起效慢、疗程长等特点，影响了其在临床上的应用。因此需要探究能增强夏枯草抗肿瘤疗效的方法。食管癌是严重危害人类健康的消化系统恶性肿瘤之一，其发生发展与多基因表达异常有关，所以研究致癌相关基因并加以干预具有重要意义。Survivin 基因在多种肿瘤的发生发展中发挥作用，参与调控细胞凋亡和细胞周期，是最强的凋亡抑制因子之一，下调Survivin 基因表达可以促进肿瘤细胞的凋亡，Survivin 基因参与调控食管癌ERK 信号传导通路，Survivin 蛋白表达与食管癌分化程度和TNM 分期有关，故推测Survivin 基因可能对食管癌细胞的恶性增殖发挥重要作用。但临床实践表明，单独干预一个基因不能起到稳定持久的抗癌效果。所以本研究设计将中药夏枯草三萜类提取物与Survivin基因靶点干预联合应用，探究从调控基因表达角度，能否起到优化夏枯草抗食管癌疗效的作用及可能性，观察中药夏枯草三萜类提取物联合Survivin-siRNA对食管癌Eca-109 细胞增殖抑制、凋亡诱导作用的影响，研究两种治疗方法对食管癌Eca-109 细胞是否具有协同抑制作用，Survivin-siRNA 能否增强夏枯草的抗肿瘤敏感性，进一步探究夏枯草抗食管癌机制，为临床食管癌中医药治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

食管癌Eca-109 细胞：购自原中科院上海细胞所，传代培养后由牡丹江医学院科研中心保存；夏枯草三萜类提取物：利用大孔树脂法得到三萜类成分，用95%乙醇溶解，配成生药浓度为100 mg/ml 的夏枯草提取液，夏枯草购自广东汇群中药饮片公司（货号：粤20160301）；RPMI1640 培养基（货号：22400-0089）、胎牛血清（货号：10270-106）、胰蛋白酶（货号：25200-056）：购自Gibco 公司；RT-PCR 试剂盒（货号：RR037A）：购自takara 公司；Trizol（货号：R0016）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0011）、Survivin 抗体（货号：AS792）、GAPDH 抗体（货号：AF1186）：购自碧云天生物技术研究所；Survivin-siRNA B 套餐（货号：A10002）、siRNA-Mate 转染试剂（货号：G04003）：购自Gene Pharma 公司；Annexin-V-FITC/PI 凋亡双染试剂盒（货号：556547）：购自BD 公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（货号：BA1056）、CCK-8 试剂盒（货号：AR1160）：购自武汉博士德生物工程公司。

1.2 细胞培养

食管癌Eca-109 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基中，于37℃、5%CO饱和湿度的培养箱内培养，2～3 d 传代一次，选取处于对数生长期的细胞用于实验。

1.3 Survivin-siRNA 的选用及设计

参考文献[12]及Gen Bank 中人类Survivin 基因序列，设计靶向人Survivin 基因的特异性siRNA 序列为：正向5-′GGCUGGCUUCAUCCACUGCTT-3′，反向5′-GCAGU-GGAUGAAGCCAGCCTT-3′；无意义siRNA序列为：正向5-′CAGUCGCGUUUGCGACUGGTT-3′，反向5′-CCAGUCGCAA ACGCGACUGTT-3′。

1.4 实验分组

空白对照组：食管癌Eca-109 细胞常规培养，不进行任何处理；阴性对照组：食管癌Eca-109 细胞转染无意义siRNA；夏枯草单独处理组：夏枯草三萜类提取物处理食管癌Eca-109 细胞；siRNA 转染单独处理组：食管癌Eca-109 细胞转染Survivin-siRNA；夏枯草+siRNA 转染联合作用组：食管癌Eca-109 细胞转染Survivin-siRNA 24 h 后入夏枯草三萜类提取物。调整夏枯草三萜类提取物终浓度为168 μg/ml。

1.5 Survivin mRNA 表达检测

转染前24 h 将食管癌Eca-109 细胞以2×10/孔接种至6 孔板上，待胞增殖达到30%～50%密度时，按siRNA-Mate 操作说明进行siRNA 转染单独处理组、阴性对照组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组相应细胞转染。转染后24 h，夏枯草单独处理组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组加入夏枯草三萜类提取物，之后所有组细胞继续培养48 h 后进行指标检测。收集各组食管癌Eca-109 细胞，利用Trizol 试剂一步法提取总RNA。按照RT-PCR 试剂盒说明书进行反转录及扩增。以GAPDH 作为内参照，设计Survivin、GAPDH引物序列如下。Survivin 基因产物约363 bp，正向引物P1：5′-AGCCCTTTCTCAACGACCAC-3′，反向引物P2：5′-GCACTTTCTTCGAGTTTCC-3′；内参照GAPDH 基因产物长度约280 bp，正向引物P3：5′-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA-3′，反向引物P4：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG-3′。PCR 反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 次循环；72℃延伸10 min。扩增反应结束后将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像分析系统分析Survivin 基因表达情况。

1.6 Survivin 蛋白表达检测

收集各组食管癌Eca-109 细胞，加入RIPA 裂解缓冲液，提取总蛋白，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。采用12%SDS-PAGE 电泳分离后进行转膜、封闭，Survivin 抗体（1∶1000）、GAPDH 抗体（1∶1000）室温孵育过夜，TBST 洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（1∶1000）二抗室温孵育2 h，暗室中ECL 反应后曝光显影，用quantity one 4.6.2 软件进行分析。

1.7 CCK-8 法检测细胞增殖抑制率

在96 孔培养板上按照5×10/孔接种各组食管癌细胞，每组各接种3 孔。待细胞增殖达到30%～50%密度时，按siRNA-Mate 操作说明进行siRNA 转染单独处理组、阴性对照组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组细胞转染。细胞转染后24 h，夏枯草单独处理组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组加入夏枯草三萜类提取物，继续培养48 h 后，向所有组细胞待测孔内各加入CCK-8 试剂10 μl，培养箱孵育4 h 后于450 nm 处用酶标仪测定各孔的吸光度（optical density，OD 值）。以培养液做空白对照并调零，测3 次，取平均值。细胞增殖抑制率=1-细胞存活率，即细胞增殖抑制率=（1-实验组OD 值/空白对照组OD 值）×100%。

1.8 细胞凋亡检测

在6 孔板上按2×10接种各组食管癌细胞，待细胞增殖达到30%～50%密度时，按siRNA-Mate 操作说明进行siRNA 转染单独处理组、阴性对照组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组相应细胞转染。转染后24 h，夏枯草单独处理组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组加入夏枯草三萜类提取物，继续培养48 h 后，取各组肿瘤细胞1×10个，加入Annexin-V-FITC 4 μl，PI 5 μl，Annexin-V 结合缓冲液400 μl，室温条件下避光作用15 min，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 Survivin mRNA 表达检测

夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞Survivin mRNA 表达水平均低于空白对照组与阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞Survivin mRNA表达水平低于夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 各组食管癌细胞中Survivin mRNA 的表达情况

2.2 Survivin 蛋白表达检测

夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞Survivin 蛋白表达水平均低于空白对照组与阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞Survivin 蛋白表达水平低于夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2、表1）。

图2 各组食管癌细胞中Survivin 蛋白的表达情况

表1 各组食管癌细胞中Survivin 蛋白表达水平的比较（±s）

2.3 细胞增殖抑制率检测

夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞增殖抑制率高于空白对照组与阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞增殖抑制率高于夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 各组食管癌细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

2.4 细胞凋亡检测

流式双染结果显示，夏枯草单独处理组、siRNA转染单独处理组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞凋亡率高于空白对照组与阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；夏枯草+siRNA转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞凋亡率高于夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3、表3）。

图3 各组食管癌细胞凋亡率

表3 各组食管癌细胞凋亡率（%，±s）

3 讨论

食管癌发病率在全世界范围内居高不下，随着现代外科医学高速发展，手术辅助以放化疗的治疗方式使食管癌患者的5年生存率得到了改善，但还存在术后肿瘤转移、复发及因手术创伤、放化疗副作用等因素造成患者的生活质量降低等问题，因此中医药治疗、靶向基因干预等非手术治疗方法已成为食管癌防治研究的热点。与传统化疗药物相比，夏枯草毒副作用小，不易产生耐药，患者主观接受度高，但是夏枯草成分复杂，抗肿瘤作用起效慢，疗程长，生物利用度低，限制了其在临床上的应用。因此，有必要通过联合其他抗肿瘤策略以利于夏枯草提取物抗食管癌的临床应用及推广。

食管癌的发生与促凋亡基因和抗凋亡基因的失衡有关，其中Survivin 基因对食管癌增殖和凋亡的影响尤其显著。Survivin 基因在胚胎组织、多种恶性肿瘤组织中广泛表达，具有调节细胞周期、抑制细胞凋亡、调控肿瘤血管生成等作用。研究表明，Survivin在肿瘤组织高表达不仅与肿瘤发生有关，而且与肿瘤的淋巴转移、生存期和复发有关，抑制Survivin 基因表达能起到抑制肿瘤的作用。

基于以上原因，本研究探讨Survivin-siRNA 能否增强中药夏枯草三萜类提取物对食管癌Eca-109 细胞增殖抑制、凋亡诱导作用，从基因表达层面探究夏枯草抗食管癌作用机制。本研究结果显示，夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞Survivin mRNA及Survivin 蛋白表达水平均低于空白对照组与阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组、夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均高于空白对照组与阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞Survivin mRNA 及Survivin 蛋白表达水平均低于夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组，差异有统计学意义（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 转染联合作用组的食管癌Eca-109 细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均高于夏枯草单独处理组、siRNA 转染单独处理组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示Survivin 基因沉默与夏枯草三萜类提取物对食管癌Eca-109 细胞具有协同抑制效应，Survivin 基因沉默增加了夏枯草三萜类提取物抑制食管癌细胞增殖敏感性。夏枯草三萜类提取物联合Survivin-siRNA 从理论上有望为临床食管癌中药及靶向治疗提供新的思路和方案。推测夏枯草抗食管癌作用与抑制Survivin 基因表达密切相关，具体机制有待于进一步研究。

目前，有关Survivin-siRNA 联合中药夏枯草在食管癌治疗中的研究较少，本研究只观察了离体情况下中药夏枯草三萜类提取物联合Survivin-siRNA 对食管癌Eca-109 细胞的增殖抑制、凋亡诱导作用，今后尚需通过体内动物实验进一步验证以Survivin 作为基因靶点联合夏枯草提取物对在体食管癌的影响，以及二者联合应用作为治疗食管癌策略的有效性及可行性，为夏枯草的抗肿瘤临床应用奠定实验基础。