高效液相色谱法测定血浆中替考拉宁的血药浓度

王 钦 姚 燕

1.南通大学附属医院药学部，江苏南通 226001；2.上药控股南通有限公司，江苏南通 226001

替考拉宁临床可用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肠球菌感染的治疗，适应证主要是脓毒症、脓毒性关节炎、嗜中性粒细胞减少、脓毒性心内膜炎、骨髓炎急性发作等，且已知的不良反应发生率低。替考拉宁口服无效，与万古霉素比较，其半衰期明显延长至80～168 h，在体内约97%以原型经肾排泄，其余经肝脏代谢。现有的替考拉宁血药浓度检测方法主要有：高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色谱-串联质谱联用法、微生物检定法、荧光偏振免疫法、胶束电动毛细管色谱法等，其中，HPLC 法具有操作简单、灵敏度高、专属性好、成本较低廉等优势。治疗非严重细菌感染替考拉宁的稳态血药谷浓度需达到10～25 μg/ml，方可达到治疗效果，而治疗严重细菌感染则需达到15～30 μg/ml。此外，替考拉宁需在开始给药时给予足够的负荷剂量，再给予维持剂量，这样可迅速达到较稳定的血药谷浓度。因此，在临床实践中应合理监测其血药浓度以保证疗效。本研究采用内标法优化HPLC 法检测血浆中替考拉宁的血药浓度，旨在为临床制定更合理的给药方案提供借鉴。

1 材料与仪器

1.1 试药

替考拉宁对照品（效价：894 U/mg，中国食品药品检定研究院，批号：130374-201002）；哌拉西林钠对照品（纯度：98.0%，上海梯希爱化成工业发展有限公司，批号：5C8OB-CA）；注射用替考拉宁[赛诺菲（北京）制药有限公司，批号：CF20178，规格：0.2 g/支]；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；二氯甲烷、磷酸、磷酸二氢钾均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为Millipore 超纯水。

1.2 仪器

1100 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）（包括自动进样器、真空脱气机、四元泵、紫外检测器、色谱工作站）；Diamonsil C色谱柱（美国Agilent 公司，4.6 mm×150 mm，5 μm）；VORTEX-5 型旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；Sorvall Stratos型高速离心机（德国Thermo 公司）；BP211D 型电子分析天平（德国Sartorius 公司）；GZ-1 型多用震荡器（北京毕捷电机股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 HPLC 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液（25∶75）（用磷酸溶液调整pH 值为2.8）；柱温：30℃；流速：1.2 ml/min；进样量：20 μl；检测波长：215 nm。

2.2 溶液的配制方法

2.2.1 替考拉宁标准溶液 精密称取替考拉宁对照品100.00 mg，置50 ml 容量瓶内，加入适量10%甲醇超声溶解后稀释至刻度，反复颠倒摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，使成2.00 mg/ml 的标准溶液，置于-20℃冰箱冷冻保存。

2.2.2 内标溶液 精密称取哌拉西林钠对照品76.53 mg，置50 ml 容量瓶内，加超纯水超声溶解后稀释至刻度，反复颠倒摇匀，得1.50 mg/ml 哌拉西林钠内标储备液。精密量取取储备液1.0 ml，置10 ml容量瓶内，加超纯水超声溶解后稀释至刻度，反复颠倒摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，得150.00 μg/ml 内标溶液，置于-20℃冰箱冷冻保存。

2.2.3 血样的处理方法 量取空白血浆、标准曲线血浆或质控血浆样品400 μl 置1.5 ml 离心管内，加入50 μl“2.2.2”项下的内标溶液，再加入乙腈600 μl，涡旋震荡2 min，离心半径7 cm，离心转速12 000 r/min，离心5 min 后得上清液。将上清液900 μl 移入另一个1.5 ml 离心管内，加入二氯甲烷400 μl 萃取，涡旋震荡2 min，离心半径7 cm，离心转速12 000 r/min，离心5 min 后得上清液。经0.22 μm 微孔滤膜过滤，取上清液20 μl 进样。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性和系统适应性试验 按“2.2.3”项处理血样，按“2.1”项进样分析，HPLC 图谱见图1。结果显示，标准曲线血浆和质控血浆样品的替考拉宁（取其主要组分TA2-2 吸收峰）、内标峰形均良好，保留时间分别为7.3 min 和12.5 min。因此该方法的专属性良好。色谱柱的理论板数10 295，分离度均＞1.5，拖尾因子分别为1.02 和1.03，符合《中华人民共和国药典》的要求。

图1 HPLC 色谱图

2.3.2 标准曲线 吸取“2.2.1”项下的替考拉宁标准溶液50 μl，加入空白血浆950 μl，配制成浓度为100 μg/ml 样品A；吸取A 溶液500 μl，加入空白血浆500 μl，配制成浓度为50 μg/ml 样品B；依照同法继续稀释样品，得25.000、12.500、6.250、3.125 μg/ml 系列浓度样品C、D、E、F。按“2.2.3”项处理血样，按“2.1”项进样分析，以TA2-2 与内标峰面积比为横坐标（X），质量浓度为纵坐标（Y，μg/ml），采用加权最小二乘法，得回归方程：Y=11.295 386X-0.048 985（r=0.9987），在3.125～100.000 μg/ml 峰面积比与质量浓度呈良好的线性关系。

2.3.3 准确度 吸取“2.2.1”项下的替考拉宁标准溶液50 μl，加入空白血浆950 μl，配制成浓度为100 μg/ml样品A；吸取A 溶液250 μl，加入空白血浆500 μl，配制成浓度为33.33 μg/ml 质控样品H；依照同法继续稀释样品，得浓度为11.11、3.70 μg/ml 质控样品M、L，均平行制备5 份。按“2.2.3”项处理血样，按“2.1”项进样分析，每日各检测1 次，共检测3 d，计算批内及批间准确度。计算公式为：相对误差（relative error，RE）=（实测值/标示值）×100%，见表1。结果显示，低、中、高质量浓度质控样品的批内及批间RE 均在85%～115%范围内，表明分析方法的准确度良好。

表1 批内及批间准确度（%）

2.3.4 精密度 取“2.3.3”项下的质量浓度3.70、11.11、33.33 μg/ml 的低、中、高浓度质控样品L、M、H。按“2.2.3”项方法处理血样，按“2.1”项进样分析，每日各检测1 次，共检测3 d，计算批内及批间相对标准差（relative standard deviation，RSD），见表2。结果显示，低、中、高质量浓度质控样品的批内及批间RSD＞15%，表明分析方法的精密度良好。

表2 批内及批间精密度（%）

2.3.5 提取回收率 取 “2.3.3” 项下的质量浓度3.70、11.11、33.33 μg/ml 的低、中、高质量浓度质控样品，测定得到的峰面积用Q 指代，取“2.2.1”项下的替考拉宁标准溶液加流动相稀释的质量浓度3.70、11.11、33.33 μg/ml 的低、中、高质量浓度的替考拉宁溶液样品，测定得到的峰面积用P 指代，均平行制备5 份。按“2.2.3”项方法处理血样，按“2.1”项进样分析，并计算提取回收率=（峰面积Q/峰面积P）×100%，见表3。结果显示，低、中、高质量浓度样品的替考拉宁和内标的提取回收率均在85%～115%范围内，符合要求。

表3 提取回收率结果（%，±s，n=5）

2.4 样品测定

5 例患者静脉滴注替考拉宁0.4 g/次，1 次/d，在第2 天给药前30 min 和第6 天给药前30 min，采集静脉血2 ml，采用含乙二胺四乙酸（ethylene diamine te traacetic acid，EDTA）抗凝剂的无菌采血管保存血样。按“2.2.3”项方法处理血样，按“2.1”项进样分析，测定替考拉宁谷浓度，结果见表4。其中4 例患者的替考拉宁稳态谷浓度在10～25 μg/ml 有效谷浓度范围内，另外1 例（编号2 患者）需及时调整剂量才能保证疗效和用药安全。

表4 5 例患者不同采血时机的替考拉宁谷浓度测定结果（μg/ml）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

与甲醇-水流动相比较，乙腈-水流动相可获得更好的峰型和分离度。当乙腈与水体积比为25∶75 时，替考拉宁与内标的保留时间分别为7.3、12.5 min，且此方法的分离度均＞1.5，能满足基线分析的要求。在流动相内添加不同的离子对试剂可进一步改善分离效果和峰型，如：乙酸铵、甲酸铵、磷酸二氢钾等。结果表明，在水中加入0.01 mol/L 磷酸二氢钾时峰型较好。流动相的pH 值能影响替考拉宁和内标的保留时间，当pH 值较高时替考拉宁的保留时间较长，而内标的保留时间较短，因此选择合适的pH 值为2.8。本研究最终选择流动相为乙腈-0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液（25∶75）（用磷酸溶液调整pH 值为2.8）。

替考拉宁在215 nm 和240 nm 均有较强的紫外吸收峰，选择以上两种波长进行考察。结果发现检测波长为215 nm 时，替考拉宁和内标的峰形良好，血浆杂质吸收较弱，对测定替考拉宁影响较小；检测波长为240 nm 时，血浆杂质吸收虽弱，但替考拉宁的出峰较小，峰面积不如215 nm，此波长的检测限和定量限不如215 nm 好。因此，本研究选择215 nm 为最佳的检测波长。

3.2 内标的选择

内标法检测替考拉宁血药浓度的内标可选择对羟基苯甲酸甲酯、哌拉西林钠、苯巴比妥、香草醛、拉莫三嗪等。本研究除哌拉西林钠外，其他内标的保留时间均较短，容易和血浆样品中的其他物质混合，影响检测结果，因此选择哌拉西林钠为内标。但由于临床中可能会有同时使用替考拉宁与哌拉西拉钠的患者，这样的血样可以用外标法检测。本研究经方法学验证，外标法也可以满足方法学的相关要求。

3.3 血浆样品前处理溶剂的选择

替考拉宁稳定性虽好但极性较大，因此要选择合适的萃取试剂。血浆样本先采用乙腈沉淀蛋白后，本研究考察不同有机溶剂萃取的效果，有甲基叔丁基醚和二氯甲烷等，发现用二氯甲烷萃取样品的分离度比甲基叔丁基醚更优。所以本研究最终选择二氯甲烷作为液-液萃取有机溶剂。

综上所述，采用HPLC 法测定血浆中替考拉宁的血药浓度，方法简便可行，专属性强，标准曲线峰面积比与质量浓度呈良好的线性关系，重现性好，准确度、精密度、提取回收率等方法学指标均符合《中华人民共和国药典》要求。