滋肾醒脑汤对阿尔茨海默病模型大鼠行为学及海马组织中Caspase-3、Caspase-9表达的影响

李旭华 王钰莹 李 腾 盛 望

(1 湖南中医药大学第一附属医院，长沙，410000； 2 湖南中医药大学研究生院，长沙，410208； 3 湖南省浏阳市中医医院，浏阳，410300)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，临床主要表现为记忆力下降及认知功能减退，又称为老年性痴呆。随着人口老龄化的严重，AD的发病率不断上升，调查发现，AD已成为老年患者死亡的第3位主要原因，仅次于肿瘤及心血管疾病[1]，给患者及其家庭带来沉重的精神、经济和生活负担。本病发病机制众说纷纭，如乙酰胆碱水平低、β淀粉样蛋白(β-amyloid Peptide，Aβ)沉积、Tau蛋白异常磷酸化聚集、氧化应激等[2]，然而具体机制尚不明确，目前临床所用药物只能缓解症状，难以有效延缓疾病进展。因此，防治AD成为当今老年疾病研究领域最重要的前沿课题之一。

中医讲究整体观念，主张辨证论治，在延缓AD患者病情进展、提高患者生命质量方面有较多优势。既往研究表明，补肾填精益髓方、健胃脑愈汤、健脑益智汤、补肾填髓方等中药汤剂能有效提高AD患者的认知功能和行为能力[3-6]。本研究通过观察滋肾醒脑汤对AD大鼠模型海马组织中Caspase-3、Caspase-9表达的影响，探讨滋肾醒脑汤对大鼠脑组织中细胞凋亡作用的机制，旨在为中医药治疗AD提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级SD(Sprague Dawley)雄性大鼠，32只，6周龄，体质量250～280 g/只，由湖南中医药大学动物实验中心[许可证号：SCXK(湘)]提供，饲养于湖南中医药大学实验室动物房，室温在22～24 ℃，自然光照，明暗交替各12 h，给予充足的清洁水、普通大鼠饲料30 g/(只·24 h)，并记录每天平均每只大鼠的摄食量，适应性喂养3 d。本实验研究符合实验动物福利的基本要求，由湖南中医药大学动物实验伦理中心审查(伦理审批号：LLBH-202101060004)。

1.1.2 药物 滋肾醒脑汤组成：生地黄24 g、熟地黄24 g、山茱萸12 g、法半夏9 g、陈皮10 g、石菖蒲15 g、益智仁10 g、川芎12 g、丹参20 g、当归10 g、茯苓20 g、红景天20 g、竹沥10 g、地龙10 g。上述中药饮片均于湖南中医药大学第一附属医院购买，采用自动煎药壶煎药，2次煎汁混合后置于水浴锅内蒸发浓缩至含生药比为2.5 g/mL，4 ℃冰箱保存。盐酸多奈哌齐片(0.4 g/粒)(卫材中国药业有限公司，批号：1907012)，临用时用生理盐水配成混悬液。

1.1.3 试剂与仪器 β淀粉样蛋白25-35(Sigma公司，美国，批号：A4559-1MG)，用灭菌生理盐水配置为10 μg/μL溶液，37 ℃环境孵育1周，4 ℃保存；兔抗Caspase-3抗体(Abcam公司，英国，批号：ab2302)；兔抗Caspase-9抗体(Abcam公司，英国，批号：ab52298)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9018)；二步法试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：PV-9000)；10%水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司，批号：HT2384)、4%多聚甲醛(湖北江民泰华化工有限公司，批号：P1110)；苏木精、伊红(Wellbio公司，美国，批号：WB03008)；水迷宫系统(成都泰盟软件有限公司，型号：WMT-100S)；石蜡切片机(浙江金华益迪试验器材，型号：YD-315)；显微成像系统[中国麦克奥迪(厦门)电气股份有限公司，Motic BA210T]等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 参照沈玉先等[7]方法制备AD模型，用水合氯醛(10%，3 mL/kg)将大鼠腹腔麻醉后固定于立体定位仪上，常规备皮消毒，参照大鼠脑立体定向图谱，选取两侧海马CA1为注射区，大致在前囟后3.0 mm，中线旁2.0 mm，颅骨下3.0 mm处，用电钻钻一骨窗后垂直于脑表面垂直进针，用微量泵以0.4 μL/min的注射速度均匀注入1 μL Aβ25-35溶液，留针5 min，使溶液充分弥散，缓慢撤针，然后清洁并缝合皮肤，常规饲养。SD大鼠适应性喂养3 d，采用随机数字表法随机分为模型组和假手术组。模型组大鼠制备AD大鼠模型，造模后第4天，将造模成功的大鼠按照随机数字表法随机分成阳性对照组、中药组。假手术组大鼠海马区注射等体积生理盐水，其余操作同模型组。

1.2.2 给药方法 术后第2天起，阳性对照组、中药组每天分别予以盐酸多奈哌齐混悬液(0.45 mg/kg)、滋肾醒脑汤(18.54 mg/kg)灌胃，模型组和假手术组灌胃等体积蒸馏水，连续给药4周，每组保证6只符合要求纳入实验。末次灌胃2 h后取材。

1.2.3 检测指标与方法 Morris水迷宫测试：采用Morris水迷宫法检测各组大鼠空间学习记忆能力[7]。采用空间探索和定位航行试验，前5 d记录大鼠找到平台所需时间(即逃避潜伏期)，进行大鼠学习能力的评定；第6天撤除目标平台，测量大鼠2 min内跨越原目标平台的次数以及在目标象限停留的时间，进行大鼠记忆能力的评定。

1.2.4 苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)染色观察脑组织病理学切片 取大鼠前囟后1.0～1.5 mm区域做5 μm厚的冠状切片，二甲苯中脱蜡，无水乙醇脱水，乙醇梯度水化，苏木精染色10 min后蒸馏水冲洗，磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Solution，PBS)返蓝，1%伊红复染3 min后蒸馏水冲洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明后封片。染色后，通过光学显微镜观察每只大鼠海马区脑组织病理学变化。

1.2.5 免疫组织化学法检测海马区Caspase-3、Caspase-9的表达 将石蜡切片置于恒温箱中烘烤2 h，脱蜡至水，浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原热修复20 min，冷却后PBS(pH 7.2～7.6)洗涤；滴加一抗(Caspase-3、Caspase-9)，37 ℃孵育2 h，4 ℃过夜，PBS冲洗；加入二抗(50～100 μL抗-兔，兔-IgG抗体-HRP多聚体)，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗；滴加二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)工作液显色，蒸馏水冲洗；苏木精复染10 min，蒸馏水冲洗；透明，封片。检测并记录：于每张切片海马区随机选取5个不重叠视野(×400)，采用图像分析软件IPP(Image-Pro-Plus)测定光密度(Optical Density，IOD)，统计分析采用平均光密度(IOD/area)进行计算，结果判断以黄色或棕黄色为阳性染色。

2 结果

2.1 行为学检测 分析定位导航试验结果可知，随着训练时间的延长，各组大鼠逃避潜伏期(Escape Latency，EL)逐渐缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；训练第1天和第2天，各组大鼠EL差异无统计学意义(P>0.05)；从第3天开始，模型组大鼠EL较假手术组明显延长；至第4天，与模型组比较，中药组及阳性对照组EL均明显缩短(P<0.05或P<0.01)。分析大鼠空间探索试验结果，与假手术组比较，模型组大鼠运动轨迹杂乱，经过跨越平台次数明显减少，且目标象限停留时间明显缩短(P<0.05)；中药组及阳性对照组较假手术组跨越平台次数、平台象限停留时间均明显增加，差异均有统计学意义(均P<0.05)，且运动轨迹逐渐趋向规则。见表1～2。

2.2 HE染色检测脑组织病理学变化 光镜下观察大鼠梗死侧海马CA1区神经元细胞病理学变化，假手术组细胞排列规整，结构完整而清晰；模型组神经元细胞排列散乱，细胞间隙增宽，细胞形态结构改变，胞核出现皱缩、破裂以及空腔等现象，可见部分死亡神经元细胞，神经元数量较假手术组明显减少；中药组和阳性对照组神经元细胞形态结构及排列情况均较模型组好转。见图1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期

表2 各组大鼠空间探索试验结果

图1 各组海马CA1区神经细胞病理学比较(HE染色，×400)

2.3 免疫组织化学法检测海马区Caspase-3、Caspase-9的表达 假手术组Caspase-3、Caspase-9见少量表达，模型组、中药组和阳性对照组Caspase-3、Caspase-9均高于假手术组(均P<0.05)，造模成功。中药组和阳性对照组Caspase-3、Caspase-9表达较模型组弱(均P<0.05)，中药组与阳性对照组Caspase-3、Caspase-9表达差异无统计学意义(均P>0.05)。Caspase-3、Caspase-9蛋白免疫组织化学染色结果见图2～3，平均光密度见表3。

表3 各组大鼠Caspase-3、Caspase-9蛋白表达平均光密度值

3 讨论

在中医学中，AD归属于“痴呆”“虚劳”“健忘”“呆病”等范畴。《灵枢》曰：“脑为髓之海。”《素问·五藏生成》云：“诸髓者，皆属于脑。”因脑为元神之府，总统诸神，故AD病位主要在脑。《管子·水池》曰：“肾生脑。”故其发病与肾密切关系。清代王清任《医林改错·脑髓说》云：“高年无记性者，脑髓渐空，年老气血不足，脑髓失养，发为痴呆。”AD主要发生在老年人，因脑为髓之海，肾藏精，主骨生髓通脑，故肾脏生精而髓海得充，脑方能正常发挥其功能。若年老肾精亏虚，髓海不足，脑失充养，加之精神刺激及瘀血、痰浊等实性病机的夹杂，最终发为虚实夹杂的神志疾病。湖南名老中医药专家胡国恒教授提出“肾脑同治”的治法，拟滋肾醒脑汤补肾生髓、活血化痰，方中生地黄、熟地黄、山茱萸补肾益精填髓，如此脑髓充则精明之腑有所养；法半夏、茯苓、石菖蒲化痰开窍；当归、川芎、丹参、红景天活血化瘀；竹沥、地龙豁痰通络。全方共奏补肾填精、活血化痰、醒脑开窍之效。

既往研究表明，细胞色素C释放至细胞质后可诱发细胞凋亡，其首要因素是激活Caspase[8-10]，说明Caspase家族在细胞凋亡中发挥关键作用。Caspase-9和Caspase-3是Caspase家族成员，正常情况下以无活性的酶原存在，当细胞凋亡信号发出后，二者在内源性凋亡的调控中扮演重要作用，Caspase-9是内源性细胞凋亡途径中重要起始因子，被认为是内源性凋亡途径的“执行者”；而Caspase-3作为凋亡级联反应中的下游凋亡因子，促进细胞凋亡的发生，被认为是诱导细胞凋亡真正的“实施者”，被称为“死亡蛋白酶”[11-13]。Caspase-3是Caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用[14]。目前已经发现的3条诱导细胞凋亡的通路(线粒体/细胞色素C通路、死亡受体通路和内质网通路)均在Caspase-3处会合，激活下游底物，通过裂解肌动蛋白、膜收缩蛋白、角蛋白等，使细胞骨架结构破坏，内环境稳态失衡，呈现凋亡的共同特点[15-16]。Caspase家族激活在许多脑缺血再灌注模型中都可以观察到，其表达越高，脑梗死越明显[17]，而Caspase基因敲除或应用Caspase抑制剂时脑梗死的体积明显缩小[18-19]，体外模型同样发现，对于氧糖剥夺(Oxygen-Glucose Deprivation，OGD)模型，Caspase-3基因缺失的神经元较正常神经元耐受力强[20]。这说明Caspase-3使细胞凋亡级联反应放大，细胞死亡增多。因此检测实验过程中-9和-3的表达水平能在一定程度上反映细胞凋亡的程度。

图2 各组大鼠脑组织(海马区)Caspase-3比较(免疫组织化学染色，×400)

图3 各组大鼠脑组织(海马区)Caspase-9比较(免疫组织化学染色，×400)

本研究结果显示，较假手术组相比，模型组大鼠双侧海马经侧脑室注入Aβ25-35后，逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数明显减少，目标象限停留时间缩短，出现明显学习记忆能力下降，表明造模成功。HE染色结果显示，假手术组神经元细胞结构清晰、排列规整，模型组神经元细胞损伤严重，而中药组和阳性对照组神经元细胞损伤情况均较模型组减轻。免疫组织化学结果显示，模型组、中药组和阳性对照组-3、-9均高于假手术组(P<0.05)，说明造模成功，中药组和阳性对照组-3、-9表达较模型组弱均(P<0.05)。

综上所述，本研究通过水迷宫实验、HE染色、免疫组织化学等检验方式，证明滋肾醒脑汤对于改善AD模型大鼠学习记忆能力可能与下调AD大鼠海马组织中-3、-9蛋白的表达密切相关，从而减少细胞凋亡，后续实验将对具体机制进行进一步研究。