山银花的研究进展及其质量标志物预测分析

朱香梅 李 晴 石雨荷 朱 珏 童巧珍,3

(1 湖南中医药大学药学院，长沙，410208； 2 湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室，长沙，410208； 3 岳阳市中医医院，岳阳，414000)

山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)，红腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)，华南忍冬(LoniceraconfusaDC.)或黄褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、凉散风热的功效，主治温病发热、痈肿疗疮、喉痹、热毒血痢等病症[1]。山银花主要含有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、环烯醚萜类、挥发油类及氨基酸类等化合物，现代药理学研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节、保肝、降糖等作用[2]。山银花是一种药食同源的药材，除了有很高的药用价值以外，其作为保健饮品和功能性食品也非常受人们的喜爱。栽培方式、产地品种、采收季节、加工方式等多种因素均能影响山银花化学成分的变化，从而影响其药材品质。山银花为2020年版《中华人民共和国药典》收载品种，规定了绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙作为检测的活性成分，但是市场上还流通着其他忍冬属植物作为地方或民间药用品种，不同基原植物的山银花药材及其混淆品的成分及功效均有所差异[3]。因此，山银花的品质问题成为了人们急需解决的重要问题。本文对山银花种质资源、主要的化学成分和药理作用进行了归纳总结，在结合质量标志物思路的基础上，对山银花药材质量标志物进行预测分析，以期为山银花的质量控制研究提供理论参考。

1 资源分布

全球忍冬属植物大约有200种，原产于旧大陆北部的温带及亚热带地区，主要分布于中国、韩国、朝鲜、日本、印度等。中国忍冬属植物有98种，有近1/2可供药用，全国各地均有分布。其中作为山银花主流商品来源植物主要集中在长江以南的湖南、四川、广东、贵州、广西、云南、江西、浙江、福建及海南等省区，长江以北地区部分省份也有山银花的分布，如河南、山东、安徽和湖北等省份[4]。地处北纬20°～33°，东经105°～120°之间，该区域年均温度10～18 ℃，年降水量800～2 000 mm，无霜期175～300 d，全年气候温和湿润，四季分明。山银花为多基源植物，野生资源分布广泛，且人工栽培对环境要求低。重庆秀山、湖南隆回的灰毡毛忍冬及广东新兴的华南忍冬多以药用为主，兼顾绿化；贵州黔西南地区的黄褐毛忍冬、广西忻城的红腺忍冬扎根石缝，迎风而长，以绿化为主，兼顾药用。目前，市场上的山银花多以灰毡毛忍冬为主，其次是黄褐毛忍冬、红腺忍冬，由于各种因素，山银花市场基本没有华南忍冬商品。

2 化学成分

目前，已从山银花中分离鉴定出200多种化合物，主要包括有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、生物碱类、环烯醚萜类、挥发油类、微量元素等[5-6]，其中有机酸和三萜皂苷类化合物为山银花主要药效成分。

2.1 有机酸类 常见的有机酸类化合物有绿原酸、咖啡酸、奎宁酸、柠檬酸[7]。其中绿原酸类化合物为山银花抗病毒的主要活性成分。绿原酸类化合物是咖啡酸的衍生物，大多具有咖啡酸的骨架。迄今已从山银花中分离出有机酸类成分23种。化合物见表1。有机酸类化合物提取分离方法包括微波辅助提取法、煎煮法、匀浆辅助负压空化提取法、涡流辅助基质固液分散微萃取法[8-9]。使用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)比较灰毡毛忍冬、华南忍冬、忍冬、红腺忍冬和黄褐毛忍冬的化学成分，发现有机酸类化合物的成分含量相差较大，说明山银花中有机酸类成分的含量与种质和产地有关[10]。

2.2 黄酮类 大多数药用植物中都含有黄酮类化学成分，是山银花抗菌抗病毒的主要活性成分。目前从山银花中分离得到的黄酮类化合物主要包括黄酮、二氢黄酮和黄酮醇类。它们可与多种糖链接为黄酮苷，糖多为D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖等。山银花黄酮类化合物见表2，结构见图1。

图1 山银花中黄酮类化合物结构

表1 山银花中有机酸类化合物

表2 山银花中黄酮类化合物

2.3 三萜及皂苷类 三萜及其苷类化合物是山银花的特征性成分，主要存在于山银花花蕾中，与其药理药效息息相关。目前从山银花中分离得到的三萜及其苷类化合物有35种，齐墩果酸和常春藤皂苷元是山银花三萜皂苷的主要骨架，还有少数连有绿原酸的三萜皂苷。董俊丽等[23]从灰毡毛忍冬中分离得到了7个三萜类化合物，其中灰毡毛忍冬皂苷丙(3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-l-arabinopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside，56)为新化合物，另外6个化合物(57～62、70)首次从山银花中分离得到。化合物见表3，结构见图2。

2.4 环烯醚萜类 环烯醚萜苷类化合物是忍冬属植物的主要水溶性成分，常以苷的形式存在，也是一种特殊的具有缩醛或半缩醛结构的单萜化合物[41]。目前，山银花中环烯醚萜苷类化合物药理活性研究主要在抗炎、止痛、解热、保肝及抗病毒方面。然而，关于山银花环烯醚萜苷类化合物研究报道较少，主要在灰毡毛忍冬和红腺忍冬中发现少数的环烯醚萜苷类化合物。化合物见表4，结构见图3。

表3 山银花中三萜及皂苷类化合物

续表3 山银花中三萜及皂苷类化合物

图2 山银花中三萜及其苷类化合物结构

表4 山银花中环烯醚萜类化合物

图3 山银花中环烯醚萜类化合物结构

2.5 挥发油类 挥发油类化合物是灰毡毛忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬来源的山银花有效成分之一，具有良好的抑菌作用，常用于医药、化妆、香料、食品等工业方面[36]。山银花挥发油成分主要包括烃类、醇类、醛类、酸类，酮类等，其中烃类成分、醇类成分、醛类成分含量最高的为灰毡毛忍冬，而红腺忍冬酯类成分和酸类成分含量最高，黄褐毛忍冬酮类总含量最高[39]。水蒸气蒸馏法和超临界CO2流体萃取法是山银花挥发油最常用的提取方法，顶空-固相微萃取技术操作简单、样品用量少，近年来逐渐应用于山银花挥发油提取[40]。不同产地、不同来源、不同用药部位的山银花挥发油种类、相对含量不同，其中挥发油相对含量>1%的主要有46种。化合物见表5。

2.6 氨基酸类 山银花中检测到氨基酸有17种，包括天冬氨酸(L-aspartic Acid，134)，苏氨酸(L-threonine，135)、缬氨酸(Valine，136)、甲硫氨酸(DL-methionine，137)、异亮氨酸(Isoleucine，138)、亮氨酸(Leucine，139)、苯丙氨酸(L-phenylalanine，140)、赖氨酸(Lysine，141)、丝氨酸(L-serine，142)、谷氨酸(Glutamic Acid，143)、甘氨酸(Glycine，144)、丙氨酸(Alanine，145)、半胱氨酸(Cysteine，146)、酪氨酸(Tyrosine，147)、组氨酸(Histidine，148)、L-精氨酸(L-arginine，149)、脯氨酸(Proline，150)，其中化合物(135～141)是从山银花中检测出的人体必需氨基酸[42]。化合物结构见图4。

图4 山银花中必需氨基酸类化合物结构

2.7 其他成分 除了以上提到的化合物，山银花中还有其他类型的化合物已被分离出来，如香豆素、糖苷、甾类、单萜和倍半萜。如东莨菪素(Scopoletin、151)、3，3′-二氧甲基鞣花酸(3，3′-dioxymethylellagic acid，152)、原儿茶醛(Protocatechualdehyde、153)、18-hydroxy-13-epi-manoyloxide(154)、Excoecarin C(155)、Ribenol(156)、反式-芳樟醇-3，7-氧化物-6-O-β-D-葡萄糖苷(Trans linalool-3,7-oxide-6-o-β-D-glucoside，157)、(2E,6E)-3,7-二甲基-8-羟基八二烯-1-O-β-D-葡萄糖苷(2E,6E-3,7-dimethyl-8-hydroxyoctadiene-1-o-β-D-glucoside，158)、白果醇(10S-nonacosan-10-ol，159)、β-谷甾醇(Beta-Sitosterol，160)、豆甾醇(Stigmastero，161)[13,16,20,24,26,29,31]。梅玉丹等[21]首次从灰毡毛忍冬中分离得到4个新的化合物，包括Kankanoside E(162)、Betulalbuside A(163)、Shomaside F(164)和Amarantholidoside V(165)。部分化学结构见图5。此外，山银花中还含有一定的蛋白质、多糖成分及Fe、Mn、Zn、Cu、Ni等微量元素。

表5 山银花挥发油类化合物

图5 山银花中其他类化合物结构

3 药理作用

3.1 抑菌、抗病毒 山银花中的酚酸类成分具有较好的抑菌、抗病毒能力，尤其是抗金黄色葡萄球菌和乙型链球菌[43]。另有研究表明，山银花总三萜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、化脓性链球菌和肺炎链球菌5种菌株都有明显的抗菌活性[44]。通过H1N1病毒感染体外培养的犬肾小管上皮细胞(MDCK细胞)发现，山银花水提液具有体外抗H1N1病毒的作用，且以治疗给药和直接杀灭给药抗病毒作用较好[45]。山银花黄酮对体外伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)感染的细胞复制具有抑制作用，机制为阻断PRV的吸附，抑制病毒增殖和中和病毒包膜蛋白，且山银花黄酮类化合物木犀草素、木犀草苷常作为抗呼吸道病毒感染的活性物质[46]。

3.2 抗氧化、调节免疫力 使用不同的溶剂萃取山银花的有效成分，发现各基源山银花提取物均有良好的抗氧化活性，以乙酸乙酯萃取部位的抗氧化能力最强，可将大鼠胰岛素瘤上皮细胞中抗氧化酶超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、过氧化氢酶的活性提高[47]。山银花中绿原酸、总黄酮和多糖类成分均能清除DPPH(2,4,6-trinitrophenyl)Hydrazyl Stable Free Radical、·OH和O2-·自由基，抵抗H2O2氧化损伤，进而恢复细胞活性[48-49]。另外研究发现，山银花粗多糖对小鼠的巨噬细胞吞噬功能、体液免疫及体外细胞免疫有提高的作用[50]。灰毡毛忍冬提取液能显著提高腹腔注射环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型的胸腺指数、脾脏指数、碳廓清指数和巨噬细胞吞噬指数，促进免疫低下小鼠免疫细胞的增殖，具有较强的免疫调节作用[51]。

3.3 抗炎、抗肿瘤 山银花绿原酸、木犀草苷均有不同程度的抗炎活性，能够抑制细胞内炎症介质白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)的释放，其机制可能与影响花生四烯酸(Arachidonic Acid，AA)代谢、抑制核因子κB信号通路活化有关[52-53]。有研究者发现灰毡毛忍冬花蕾中的2α，24-二羟基-23-去甲熊果酸和2α，4α-二羟基-23-去甲熊果酸对脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)诱导的RAW264.7细胞有显著的抗炎作用，能抑制诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)[54]。3,4-二咖啡酰奎宁酸能抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的生长和增殖，还能够诱导HepG2细胞发生凋亡[55]，灰毡毛忍冬次皂苷乙对体外多种肿瘤细胞均具有抑制增殖的作用，其机制与多腺苷二磷酸-核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose) Polymerase，PARP]降解、细胞凋亡蛋白酶级联反应的激活及Bax/Bcl-2蛋白比升高有关[56]。

3.4 保肝、解热 早前研究者发现山银花中三萜皂苷类化合物通过降低小鼠肝微粒体细胞色素P-450，达到保肝的作用[57]。山银花水提物可以显著降低四氯化碳、乙酰氨基酚和乙醇诱导的肝损伤小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性、使肝匀浆中升高的丙二醛含量以及肝脏系数下降，显著升高肝匀浆中超氧化物歧化酶含量，显著减轻四氯化碳和乙醇对肝组织的病理学损害[58-59]。山银花黄酮类提取物对脂变人肝L-02细胞三酰甘油蓄积有改善作用，其机制可能与固醇激素调节元件结合蛋白-1c及基因表达下调有一定关系，为从山银花中开发防治脂肪肝新药提供了一定的理论依据[60]。体内实验研究表明，各基源山银花均有较好的体内解热作用，且以灰毡毛忍冬效果最佳。雷志钧等[61]发现灰毡毛忍冬水提液能够抑制新鲜啤酒酵母菌致热大鼠的发热趋势，但在致热6 h后灰毡毛忍冬组基本上没有解热作用。

3.5 其他作用 山银花在预防心血管疾病中也具有显著的作用。李冲等[62]采用盐酸异丙肾上腺素皮下注射制备了大鼠急性心肌缺血氧化损伤模型，连续灌胃不同浓度山银花黄酮粗提物，结果发现大鼠血清中丙二醛含量减少，肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性降低，超氧化物歧化酶活性回升，山银花黄酮类物质对急性心肌缺血氧化损伤大鼠具有保护作用。山银花提取物还可以降低荷脂细胞内胆固醇含量，具有较强的抗动脉粥样硬化作用[63]。此外，有研究发现不同基源的山银花多糖部位均能改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠糖、脂代谢紊乱，具有显著降糖作用[64]。

4 质量标志物预测分析

质量标志物是由刘昌孝院士等在研究现有质量评价与控制方法及存在问题的基础上，提出的中药质量控制的新概念[65-66]，指存在于一些中药或者中药产品中，与中药的质量、疗效等属性相关的物质，作为反映中药安全性和有效性的标志性物质进行质量控制。它的核心理论本质上是以中医药理论和相关植物学科理论为基础，以现代化学生物学技术为研究方法，系统解析与有效性密切相关的中药内在化学质量属性，提炼质量控制指标，建立多元质量评价方法，最终实现建立全程质量控制体系的目的[67]。山银花是一种多基源植物，种质资源丰富，化学成分复杂，本文通过文献分析，对山银花进行了质量标志物预测，为山银花药材科学的质量控制方法提供参考依据。

4.1 基于不同产地及植物亲缘学化学成分特有的质量标志物预测分析 山银花中存在多种化学成分，主要包括有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、环烯醚萜类、挥发油类及微量元素等，其中有机酸类和三萜皂苷类化合是其主要的药效成分。有研究者同时测定灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、红腺忍冬中7个有机酸类成分，绿原酸和3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸普遍存在于各批山银花药材中，且含量较高，不同产地华南忍冬中绿原酸含量有一定的差异[68]。王浩兵等[69]利用超高效液相色谱(Ultra-High Performance Liquid Chromatography ，UPLC)法测定不同产地山银花和金银花中9种成分，结果发现绿原酸含量较高的是四川、湖南，且灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙只能在山银花中检测到。故绿原酸、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙可作为山银花质量标志物筛选的重要依据。

4.2 基于药动学的质量标志物预测分析 山银花不仅有保护心血管的功效，还可以预防和治疗癌症，主要的药效成分是有机酸类化合物。Zhou等[70]提取山银花中的有机酸类成分并研究其在大鼠体内的药动学，结果表明绿原酸的含量在大鼠体内最高。中药材质量控制中的药物提取动力学研究占有重要地位。杨姣等[71]建立了中药材成分封闭体系提取动力学模型，并采用HPLC法检测山银花绿原酸有效含量W0及分配系数ρ2，测定山银花绿原酸提取动力学药时曲线，结果表明山银花绿原酸提取动力学符合三室模型。因此，绿原酸可作为山银花药材质量标志物的指标。

4.3 基于传统药性的质量标志物预测分析 中药药性理论是古代医药学家对药物作用效果的内在机制的认识，能在一定程度上反映出某些或某类药物的客观本质，也是中药基本理论体系所特有的核心内容之一[72]。因此也应作为质量标志物确定的依据之一。有研究表明中药的物质基础可以决定其性能，而中药的药理作用能够揭露中药药性的神奇面纱，看出药物对机体的作用关系，细胞是怎样和分子之间作用的[73]。《中华人民共和国药典》2020年版中记载山银花性甘、寒，归肺、心、胃经。现代研究表明，甘寒药物的物质基础多以糖类、皂苷和氨基酸为主[74]，目前在山银花中已检测到17种氨基酸，其中谷氨酸、赖氨酸、亮氨酸在各批山银花中含量较高。因此，可将赖氨酸、亮氨酸、谷氨酸及三萜苷类成分作为山银花表达性味的物质基础，应将其作为山银花质量标志物选择的重要参考依据。

4.4 基于传统药效的质量标志物预测分析 山银花功效主治：清热解毒，疏风散热。用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热。山银花中挥发性成分苯乙醇、酚酸类成分绿原酸和咖啡酰奎宁酸均具有抗菌、抗炎、抗病毒、解热等作用，用于温邪蕴而成毒，热毒上熏咽喉之疾，清利咽喉。山银花中黄酮类成分木犀草素、忍冬苦苷、木犀草苷等，均有抗炎、抗氧化、抗菌的作用，能消除风热病邪，疏散风热的功效[75]。另外，山银花还具有解毒作用，体内研究表明，山银花中的咖啡酸、木犀草苷能够减少甲型流感病毒肺炎小鼠的死亡率，能较好地改善流感病毒肺炎小鼠的肺组织炎症[76]。综合考虑各化合物在山银花中的含量及其传统功效，绿原酸、咖啡酸、苯乙醇及木犀草苷可以作为山银花质量标志物选择的参考。

4.5 基于不同加工方法的质量标志物预测分析 山银花的加工方法主要包括：晒干法、阴干法、烘干法、蒸干法、杀青干燥法、熏硫干燥法，还有微波干燥、真空干燥、远红外干燥。研究表明，不同加工条件影响着山银花中有机酸、挥发油、三萜苷类等化学成分含量的变化。蔡嘉洛等[77]、王芳等[78]研究结果显示，山银花中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、木犀草苷在不同的加工条件下含量有明显的差异。山银花挥发油中的芳樟醇在不同的加工条件下存在明显的差异[79]。因此，可将绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、木犀草苷、芳樟醇作为考察不同加工条件下山银花的质量标志物。

4.6 基于不同配伍中表达组分的质量标志物预测分析 2020年版《中华人民共和国药典》中金银花为单一来源，而山银花有4种植物来源：忍冬科植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬和黄褐毛忍冬[1]。表明在2005年以前，山银花一直作为金银花的主流商品，用于临床配伍使用。

山银花具有清热利咽的作用，在临床中与各种中药组成不同的方剂，从而达到不一样的治疗效果。在银翘马勃散方中，山银花配伍连翘、牛蒡子、射干、马勃，具有清热、解毒、利咽的功效，主要运用于治疗咽喉部的炎症性病变，此时的山银花的抗炎成分发挥主要作用。山银花性味甘寒，清热解毒的同时，兼有疏散风热之力，用于治疗风热感冒、温病发热、热毒血痢等病症。在银翘散方剂中，山银花作为君药，与牛蒡子、生甘草、芥穗等10余味药配伍，有清热解毒，发散表邪之效，常用于治疗温病初期出现的症状，山银花在此方剂中所表达的组分为解热、抗病毒成分。现代药理研究发现山银花有机酸类中的绿原酸、咖啡酸及黄酮类化合物与解热、抗炎、抗病毒作用有关，应将其抗病毒、抗炎、解热成分作为方剂配伍质量标志物的选择参考。

5 结语与展望

山银花具有凉血、解毒通络和散结消肿的功效，是治疗暑热感冒、牙龈肿痛的常用药材，此外，山银花还可以保护肝脏，预防癌症。山银花除了作为中成药、中药制剂等的原料应用于临床，也应用于美容、保健、食品等方面。本文在总结山银花化学成分和药理作用研究进展的基础上，以中药质量标志物的理论为指导，根据山银花化学成分特有性、传统功效及药性、药代动力学、不同加工条件等几个方面对山银花的质量标志物进行预测分析，可将绿原酸、咖啡酸、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、木犀草苷和芳樟醇、苯乙醇作为山银花的质量标志物，以期为山银花的质量控制和质量标准制定的研究提供理论参考。接下来本课题组将基于山银花质量标志物的预测分析对其质量进行深入研究，筛选出山银花的质量标志物，建立质量分析评价方法和山银花质量控制体系。