不同产地的当归中苯酞类成分的含量测定及聚类分析

龚 韬 杨 薇 王 夏 周德勇 拱健婷 李 莉 宋京美 胡银燕

北京市临床药学研究所，北京 100035

当归是伞形科植物当归的干燥根，性甘、辛、温；归肝、心、脾经。具有补血活血、调经止痛，润肠通便之功效[1]。主要分布在甘肃、云南、四川等地。现代研究表明，当归中的化合物主要包括挥发油、有机酸、多糖和黄酮等成分，其中挥发油为当归的有效成分之一，具有改善学习记忆能力、抗氧化损伤等多重药理作用，按化学结构其主要成分可分为苯酞类和苯酞二聚体类化合物，其中藁本内酯的含量最高[2-9]。2020 年版《中华人民共和国药典》[1]中当归含量测定项下仅收载了挥发油总量和阿魏酸含量，但对挥发油中的具体成分并未规定其含量测定项。基于此，为更系统、更全面地进行当归的质量评价，本研究建立了多波长高效液相色谱法（high performance liquid chromatograph，HPLC）测定当归中洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯和丁烯基苯酞4 种苯酞类成分的含量，并对不同产地当归的头和身两个部位的洋川芎内酯I、藁本内酯和丁烯基苯酞3 种成分进行聚类分析，以期为当归的质量评价、标准完善以及合理的开发利用提供参考和依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo UltiMate3000 型超高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Mettler Toledo XP105 型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

1.2 材料

对照品：洋川芎内酯I（货号：P10OBF45372）、洋川芎内酯A（货号：P03N8F47409）、丁烯基苯酞（货号：T04N8Z47410）均购自上海源叶生物科技有限公司；藁本内酯（货号：C10106732）购自上海麦克林生化科技有限公司。乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯。不同产地当归样品来源信息见表1，经北京市临床药学研究所中药资源室李莉研究员鉴定为伞形科植物当归Diels 的干燥根。

表1 不同产地当归样品来源信息

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取4 种对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml 含洋川芎内酯I 2.34 μg、洋川芎内酯A 4.46 μg、藁本内酯166.4 μg、丁烯基苯酞2.08 μg的混合溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取当归粉末（B-2-头）（过三号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶柱（Agilent Eclipse Plus C18，4.6 mm×150 mm，3.5 μm）为色谱柱；流动相为乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0～20 min，92%→74%B；20～25 min，74%→60%B；25～60 min，60%B）；柱温35℃；检测波长：洋川芎内酯I、洋川芎内酯A 为284 nm，藁本内酯为326 nm，丁烯基苯酞为260 nm；流速1 ml/min。此条件下4 种成分与其他组分均能达到基线分离，色谱图见图1。

图1 当归4 种苯酞类成分高效液相色谱图谱

2.4 线性关系考察

取洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成一系列混合对照品溶液，浓度分别为5.85×10-4～2.34×10-2、1.12×10-3～4.46×10-2、4.16×10-2～1.664、5.20×10-4～2.08×10-2mg/ml。按“2.3”项下色谱条件分别进样10 μl，以对照品进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。见表2。

表2 4 种苯酞类成分的线性关系

2.5 方法学考察

2.5.1 稳定性考察 精密吸取“2.2”项下同一份供试品溶液10 μl，于0、4、8、12、16、20、24 h 按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。计算得洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞4 种成分峰面积的RSD 值分别为4.07%、1.92%、0.68%、4.23%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性较好。

2.5.2 重复性考察 精密称取同一批次当归样品（B-2-头）6 份，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液，分别进样10 μl，按“2.3”项下色谱条件测定，计算得到洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞4 种成分含量分别为0.0346%、0.0181%、1.0410%、0.0203%，RSD 分别为2.86%、3.24%、1.10%、1.59%，表明该方法重复性良好。

2.5.3 准确度（回收率）考察 采用加样回收法。精密称取已知含量的同一批当归样品（B-2-头）0.15 g，共9 份，精密加入已知含量的对照品溶液25 ml，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μl，按“2.3”项下色谱条件测定，计算含量及加样回收率。见表3。

表3 当归四种苯酞类成分加样回收试验结果

2.6 不同产地当归样品测定

不同产地的当归样品充分干燥后，按当归头、当归身不同部位进行取样，粉碎，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件测定，得到洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞4 种成分含量。

2.7 数据处理结果

采用Graphpad Prism 8.0 软件对10 个产地的89 批样品做雨点分布图，结果见图2。结果显示，不同产地的当归样品中4 种苯酞类成分含量相差较大，部分产地样品中无洋川芎内酯A；洋川芎内酯I 和丁烯基苯酞的含量数据比藁本内酯要分散，同一产地的不同批次间数据波动较大。

图2 不同产地当归中苯酞类成分雨点图

2.8 聚类分析

以所测洋川芎内酯I、藁本内酯、丁烯基苯酞3 种成分的含量作为原始数据，采用SPSS 26.0 软件标准化处理数据，以Ward 接法结合Squared Euclidean Distance 距离计算方法对10 个产地的当归样品按不同部位进行聚类分析，结果见图3。对于当归头，当判定距离＜25 时，样品可聚为2 类，产地编码H、I、J 为一类，其余产地为一类；当判定距离<5 时，样品则可聚为4 类，分别是产地编码B、G、K 为一类，A、C、D 为一类，E 单独为一类；H、I、J 为一类。对于当归身，当判定距离＜25 时，样品可聚为2 类，产地编码G、H、I、J为一类，其余产地的为一类；当判定距离<5 时，样品则聚为3 类，分别是产地编码G、H、I、J 为一类，A、B、C、E 为一类，D、K 为一类。

图3 不同产地当归的聚类分析

3 讨论

3.1 流动相的选择

参考了已有的关于当归有效成分的含量测定及指纹图谱、特征图谱的报道[10-20]，考察对比了不同色谱系统对样品分离的影响，最终选用乙腈-水系统作为色谱系统，并采用梯度洗脱。

3.2 检测波长的选择

由于样品中4 种成分的含量相差悬殊，藁苯内酯的含量是另3 种成分的10～100 倍，因此采用了各个成分的最佳检测波长，以期收到较好的检出结果。

3.3 供试品溶液制备条件的优化

由于苯酞类成分稳定性差，故选取超声处理作为提取方式，以甲醇作为提取溶媒。根据提取溶媒体积和提取时间的考察结果，确定样品的提取方式为甲醇超声处理30 min，溶媒体积为25 ml。

3.4 小结

本研究建立了当归中4 种苯酞类成分的含量测定方法，该方法操作简单，专属性强，准确性高。不同产地当归中苯酞类成分的含量差异显著，可为有关当归药材开发产地选择提供基础研究数据。聚类分析根据不同阈值范围可把10 个产地89 批当归样品分为2 大类或3～4 小类，总体来看，云南曲靖1、云南怒江2 和云南白药基地1 三个产地的可归属为一类，提示以藁本内酯等苯酞类化学成分为指标的当归药材在地理环境方面的差异是客观存在的。本研究由于采集的各个产地的当归样品数量一致性欠佳，样本数不齐，可能会造成数据统计上的偏差。当归在临床上应用非常广泛，因此有必要进一步扩大样本量以掌握各个产地当归药材的总体情况，更全面、系统地进行质量评价[21-25]。