蒙药阿嘎如-25 对小鼠肺纤维化的影响

贾 若 王永清 杨雨民 李艳华 苏宝科 刘立新

1.内蒙古自治区中医医院急诊科，内蒙古呼和浩特 010050；2.内蒙古自治区中医医院老年病科，内蒙古呼和浩特 010050

肺纤维化是一种以累及肺间质、肺泡和/或细支气管为基本病变特点的疾病，有慢性进展性、致死性等特点，治疗困难，预后极差，严重威胁了患者的健康[1-5]。研究证实，肺纤维化因过多细胞外基质沉积（extracellular matrix，ECM）而成。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是纤维化启动和进程的关键因子[6-11]，Smad3 是TGF-β1 信号转导中最重要的分子，可调节反向基因的转录[12-13]，TGF-β1/Smad 信号通路被激活，对肌成纤维细胞（myofibroblast，MB）的形成、肺泡上皮细胞与内皮细胞的间质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）、ECM 的沉积均有重要影响[14]。纤维连接蛋白（fibronectin，FN），对于肺纤维化的发生发展起着非常重要的作用[15]，骨桥蛋白（osteopontin，OPN）可促进TGF-β1 的活化，促进纤维化的进展[16]。本研究以TGF-β1/Smad3 信号通路为切入点，研究蒙药阿嘎如-25 治疗肺纤维化的具体分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

主要试剂：TGF-β1（货号：ER31210，HUABIO）；p-Smad3（货号：ET1609-41，HUABIO）；FN（货号：ET1702-25，HUABIO）；OPN（货号：AF0227，Affinity）。

实验药物：博来霉素（bleomycin，BLM）（invitrogen，货号：R250-1）；养阴益肺通络丸（北京康益德中西医结合肺科医院，批号京药制字：20100002）；吡非尼酮胶囊（北京康蒂尼药业有限公司，生产批号：H2013376）；蒙药阿嘎如-25（内蒙古自治区国际蒙医医院制剂中心）。

1.2 实验动物

健康SPF 级雄性C57BL/6 小鼠72 只[斯贝福北京生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2019-0010，合格证号：110324200102508615]，平均体重（20±2）g，饲养于SPF 级屏障实验室，饲养室温度为22～25℃，湿度44%～49%，本研究经实验动物伦理委员会审批（20190927-1）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的建立 随机选取10 只健康SPF 级C57BL/6 小鼠作为正常组，其余62 只小鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 ml/kg）麻醉，管内注入BLM 稀释液（按3.5 mg/kg剂量稀释，溶剂为0.9%氯化钠注射液）50 μl建立肺纤维化模型，确定肺间质纤维化及肺泡炎的程度参照文献[12-13]的方法。

1.3.2 分组及给药 造模后第28 天，死亡7 只，其余小鼠按随机数字表法分为模型组（n=10）、西药组（吡非尼酮胶囊）（n=9）、中药组（养阴益肺通络丸）（n=9），蒙高组（n=9）、蒙中组（n=9）、蒙低组（n=9）。

实验药物制备：蒙药阿嘎如-25 属于《蒙医金匮》[17]经典名方，将其制成胶囊，每粒含生药0.4 g。使用时将药物烊化溶于其中。实验动物灌胃给药剂量按人鼠体表面积折算，配置浓度依次为13、6.5、3.25 mg/ml 溶液。吡非尼酮胶囊用超纯水制成浓度为0.0046 mg/ml的混悬液。灌胃给予吡非尼酮胶囊10 mg/（kg·d），给药体积均为1 ml/（100g·d）。按人日用临床剂量0.5 mg/d 计算，经人小鼠体表面积比值折算成小鼠的日用药量。模型及正常组给予等体积生理盐水灌胃，各组每日固定时间灌胃，1 次/d，均灌胃8 周。

1.3.3 检测方法 连续灌胃8 周后小鼠脱颈处死，取小鼠肺组织进行组织固定及冷冻处理。免疫组织化学染色及Masson 染色观察小鼠肺组织病理改变及纤维化，Western blot 法检测肺组织中TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白的表达，Tunel 法检测细胞凋亡率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蒙药阿嘎如-25 对小鼠肺组织病理形态及纤维化的影响

正常组小鼠肺组织结构基本正常，未见明显病理改变。模型组肺组织结构严重破坏，支气管上皮细胞部分脱落，部分肺泡萎缩，肺泡壁内可见大量红细胞，组织中可见弥散性炎症细胞浸润（单核细胞为主）。蒙高组、蒙中组、蒙低组肺组织病理形态均较模型组改善明显。见图1。

图1 各组小鼠肺组织免疫组织化学染色（200×）

正常组肺组织无明显的纤维蛋白沉积，而模型组蓝染区域增多，小鼠肺泡壁的间质纤维化局灶性纤维组织增生，肺纤维程度进一步加强，各蒙药组小鼠肺组织蓝色区域较模型组明显减少，肺纤维化程度明显减轻。模型组胶原纤维面积百分比高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；各蒙药组胶原纤维面积百分比低于模型组，蒙高组胶原纤维面积百分比低于其他蒙药组，且蒙中组低于蒙低组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表1。

图2 各组小鼠肺组织Masson 染色（200×）

表1 各组小鼠肺组织纤维化情况比较（%，）

表1 各组小鼠肺组织纤维化情况比较（%，）

注 与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与蒙低组比较，cP＜0.05；与蒙中组比较，dP＜0.05

2.2 蒙药阿嘎如-25 对小鼠肺组织TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白表达的影响

模型组TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 表达高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；各蒙药组TGFβ1、p-Smad3、FN、OPN 表达均低于模型组，蒙高组低于其他蒙药组，且蒙中组低于蒙低组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、表2。

表2 各组小鼠肺组织TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白表达情况比较（）

表2 各组小鼠肺组织TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白表达情况比较（）

注 与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与蒙低组比较，cP＜0.05；与蒙中组比较，dP＜0.05。TGF-β1：转化生长因子-β1；FN：纤维连接蛋白；OPN：骨桥蛋白

图3 各组小鼠肺组织TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白的表达

2.3 蒙药阿嘎如-25 对小鼠肺组织细胞凋亡的影响

模型组细胞凋亡率高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；各蒙药组细胞凋亡率低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；蒙高组细胞凋亡率低于其他蒙药组，且蒙中组低于蒙低组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4、表3。

图4 各组小鼠肺组织TUNEL 染色（400×）

表3 各组小鼠肺组织细胞凋亡情况比较（%，）

表3 各组小鼠肺组织细胞凋亡情况比较（%，）

注 与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与蒙低组比较，cP＜0.05；与蒙中组比较，dP＜0.05

3 讨论

研究证明，TGF-β1 可诱导一系列的信号转导过程，实现其生物学效应，最终导致纤维化[18-20]。本研究显示，蒙药阿嘎如-25 可有效改善肺纤维化小鼠的肺组织病理改变及纤维蛋白沉积情况，抑制TGF-β1/Smad3 信号通路，抑制FN、OPN 蛋白的表达，减轻细胞凋亡，且其高剂量组效果更优，不失为治疗肺纤维化的有效药物。

蒙医学说中，三根为生来固有的“赫依、希拉、巴达干”，维持机体达到“平衡状态”，而五源学说以及寒热属性中，赫依因具有轻、糙、动为主秉性成分，归属气源，呈寒热两重性[21-24]。赫依以循行之道遍布全身，上行赫依位于胸部，热症未痊愈残留于肺，迁延时久，赫依偏盛紊乱，伤及肺体素，肺通气受阻而致病。常有干咳，尤其在赫依时辰（拂晓前及夜幕降临时）为著，无痰或咳少量泡沫痰，疲乏无力，快速活动后气短，心悸，脉象空、芤，舌质红、粗糙。治宜在强身润肺，镇赫依的前提下，以对症治疗为原则。蒙药方剂阿嘎如-25（蒙药名）[25]，主治：上下内外各种赫依病，尤其偏于清镇内赫依病病证。对于上下内外各种赫依病均有裨益。

综上所述，肺纤维化严重威胁着人们的健康，吡非尼酮价格昂贵，治疗不易坚持，中药和蒙药较西药都有价格便宜、容易坚持等特点，但蒙药药剂在本研究中体现了更好的治疗效果，明确了蒙药阿嘎如-25调控肺间质细胞干预促肺纤维化/抗肺纤维化耦联治疗肺纤维化的效应及分子途径，构建“清镇赫依（蒙药阿嘎如-25）-顺气化痰（清镇肺赫依）-抗肺纤维化（干预促肺纤维化/抗肺纤维化耦联）”的药效关系模型，为临床治疗提供了依据。