雷帕霉素对非酒精性脂肪性肝病大鼠的影响

谭丽萍 陈文慧 石安华 武俊紫 朱晓松 张 珊

1.云南中医药大学基础医学院，云南昆明 650500；2.云南中医药大学徐宏喜专家工作站，云南昆明 650500；3.云南中医药大学云南省高校中医证候微观辨证重点实验室，云南昆明 650500

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率逐年上升，已成为21 世纪全球排名第一的慢性肝病，现全球患病率约25%，严重影响人类健康[1-2]。细胞自噬参与NAFLD 发生发展过程，其可通过调节脂质代谢、改善肝细胞损伤和胰岛素抵抗、减少氧化应激等环节有效治疗NAFLD[3-4]，自噬调节已成为治疗NAFLD 的潜在靶点[5]。雷帕霉素可抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白而激活自噬，为自噬研究中最常用的药物[6]。雷帕霉素在动脉粥样硬化及机械通气导致膈肌脂质代谢异常中均有缓解局部病变的作用[7-8]，由此本研究希望通过雷帕霉素治疗高糖高脂建立的NAFLD 大鼠模型，探讨其治疗NAFLD 的效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD 大鼠24 只，体重180～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002，动物合格证号：430047000 57203。本研究经云南中医药大学实验动物伦理委员会批准（R-06201926）。

1.2 主要仪器与试剂

CM 1860UV 冷冻切片机、RM235 石蜡切片机（德国LEICA 公司），Cobas C311 全自动生化仪（瑞士罗氏公司），DNM-9602 全自动酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司），DYY-6C 电泳仪（北京六一仪器厂产品）。雷帕霉素购自美国Sigma 公司（批号：R0395）。自噬相关蛋白Beclin1 抗体（批号：ab207612）、微管相关蛋白1 轻链3B（light chain 3B，LC3B）抗体（批号：ab48394）购自英国abcam 公司，泛素结合蛋白p62 抗体（批号：A11250）、自噬相关蛋白ATG5 抗体（批号：A0203）购自ABclonal 公司。

1.3 实验动物模型建立、分组、给药

随机选取8 只大鼠作为正常组，普通饲料喂养。剩余16 只采用高糖高脂饲料（59.5%常规饲料、10.0%猪油、20.0%蔗糖、0.5%胆酸钠、10.0%蛋黄粉）伴日常饮用5.0%红糖水的饲养方法建立NAFLD 大鼠模型，持续造模6 周后，肝组织低倍镜下可见脂肪变性肝细胞占肝小叶比例＞1/3，即出现NAFLD[9-10]，明确造模成功。将其按随机数字表法分为模型组和雷帕霉素组，每组各8 只。雷帕霉素组用2.8 mg/（kg·d）雷帕霉素灌胃[11]，正常组与模型组用0.9%NaCl 溶液灌胃，灌胃液体容积为每只大鼠2 ml/d，持续给药4 周。

1.4 生化指标检测

实验结束后，大鼠麻醉后心脏取血，用罗氏全自动生化分析仪检测三组血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、谷草转氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）、谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。三组处死并解剖，取部分肝组织，制作肝匀浆，采用TC、TG 试剂盒以GPO-PAP 法检测TC、TG。

1.5 肝脏病理检测

另取部分肝组织于4%中性甲醛固定后，通过石蜡切片进行苏木精-伊红染色，通过冰冻切片进行油红O染色。

1.6 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色

三组肝组织石蜡切片后脱蜡至水，通过抗原修复、封闭、加一抗、加二抗、显色等步骤，泛素结合蛋白p62 抗体稀释比为1∶300，ATG5 抗体稀释比为1∶50，待测蛋白与抗体结合显色呈现棕黄色，统计分析光密度。

1.7 蛋白质印迹法检测

取三组大鼠肝组织裂解匀浆，用BCA 试剂盒测定蛋白含量，待测蛋白通过电泳、转膜，最后进行免疫反应显影。Beclin1 抗体稀释比为1∶20 000，LC3B 抗体稀释比为1∶500、β-actin 抗体稀释比为1∶1000。用灰度比值进行蛋白表达水平分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组生化指标比较

模型组血清TC、TG、LDL-C、GOT、GPT 及肝组织TC、TG 高于正常组，血清HDL-C 低于正常组（P＜0.05或P＜0.01）。雷帕霉素组血清TC、TG、LDL-C、HDL-C均高于模型组，血清GOT、GPT 及肝组织TC、TG 均低于模型组（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

表1 三组生化指标比较（mmol/L，）

表1 三组生化指标比较（mmol/L，）

注 与正常组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01。TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；GOT：谷草转氨酶；GPT：谷丙转氨酶

2.2 三组肝组织病理变化

正常组肝细胞形态未见明显异常，模型组肝组织苏木精-伊红染色可见大多数肝细胞内有大小不等的脂肪空泡，油红O 染色可见大多数肝细胞内含有脂质被染成橘红色。雷帕霉素组肝组织苏木精-伊红染色及油红O 染色可见脂肪空泡和橘红色较少。见图1。

图1 三组肝组织病理变化（200×）

2.3 三组肝组织自噬相关蛋白、微管相关蛋白、泛素结合蛋白比较

模型组Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、ATG5 低于正常组，泛素结合蛋白p62 高于正常组（P＜0.05）。雷帕霉素组Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、ATG5 高于模型组，泛素结合蛋白p62 低于模型组（P＜0.05 或P＜0.01）。见表2、图2～3。

表2 三组肝组织自噬相关蛋白、微管相关蛋白、泛素结合蛋白比较（）

表2 三组肝组织自噬相关蛋白、微管相关蛋白、泛素结合蛋白比较（）

注 与正常组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01。LC3B：轻链3B

图2 三组肝组织自噬相关蛋白Beclin1 及微管相关蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ条带

3 讨论

图3 三组肝组织自噬相关蛋白ATG5 及泛素结合蛋白p62免疫组织化学染色（200×）

自噬是维持细胞内稳态的重要生命活动，当细胞内异常物质如衰老细胞器、错误折叠蛋白、脂质蓄积等增多时，自噬可通过吞噬、消化动作，清除细胞内冗余物质[12]。在NAFLD 早期单纯性脂肪肝阶段，由于肝细胞内脂质过度蓄积，导致肝细胞自噬水平降低，所以增强肝细胞自噬，促进脂质的降解与利用是NAFLD的重要治疗靶点[13-15]。自噬是动态连续的过程[16]，通过对期过程中关键蛋白Beclin1（介导自噬起始，促进自噬体成核及延伸）[17]、ATG5（促进自噬泡膜延伸）[18]、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ（促进LC3B-Ⅰ转化为LC3B-Ⅱ）[19]、p62（可在自噬溶酶体内降解）[20]的观察，能有效掌握自噬状态[21-23]。

雷帕霉素为自噬激动剂，其可抑制mTORC1 活性，促使ULK1 激活，启动自噬[24]。本研究用雷帕霉素治疗NAFLD 大鼠后，发现其会导致NAFLD 大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C 异常增高，但在肝组织内脂质蓄积减少。有研究表明，一些使用雷帕霉素进行研究的动物实验中都出现了其对机体脂代谢影响的双面性[25-27]，综合来看，使用雷帕霉素后可引起实验动物全身反应及血脂异常增高，对局部脂代谢异常脏器则有改善作用，机制可能与下调过氧化物酶体增殖物激活受体的表达、减少脂肪细胞内脂质积聚、并抑制其瘦素分泌有关[26]。本研究中，雷帕霉素通过增强肝细胞自噬水平来治疗NAFLD 大鼠效果显著，但如何选择更合适的雷帕霉素剂量及用药时间，以达到较好的治疗效果并降低其副作用是进一步研究的重要方向。