内质网应激介导心肌细胞线粒体损伤参与肺心病发病机制研究*

单 虎，张 蓉，张秋红，杨 侠，高 锦，张 洁，李雅莉，张 明△

（1.西安交通大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，西安 710004；2.陕西省人民医院消化内一科，西安 710068）

慢性肺源性心脏病是多数呼吸系统慢性疾病常见的晚期并发症，它以慢性缺氧、肺动脉高压、右心扩大和右心衰竭为主要特征[1]。慢性肺源性心脏病尚缺乏有效的特异性治疗措施，且患者就诊时常因急性呼吸道感染而表现为呼吸衰竭合并右心衰竭，预后极差[2]。因此，探索慢性肺源性心脏病的发病机制，继而寻找特异性治疗措施已成为当前重要的研究热点。肺泡慢性缺氧等因素诱导的肺动脉高压一直被认为是慢性肺源性心脏病的主要发病机制，然而直到近年来，慢性缺氧对心肌细胞的直接损伤作用才引起人们的重视[3-6]。现已证实，慢性缺氧可直接造成心肌细胞线粒体功能异常、线粒体自噬、内质网应激（ERS）、心肌细胞肥大和凋亡，其中线粒体和内质网作为心肌细胞重要的细胞器在其中发挥着重要的作用[7-9]。越来越多的研究发现，当机体遭受外界刺激导致内环境稳态失衡无法纠正时，内质网与线粒体通过结构耦联和交互作用诱导细胞凋亡[10-13]。然而，内质网在慢性缺氧环境下心肌细胞线粒体损伤中所发挥的作用尚未有研究证实。本研究拟利用慢性缺氧大鼠模型探索ERS在慢性缺氧诱发心肌细胞线粒体损伤中的作用及其机制，从而探索慢性肺源性心脏病发病机制及可能的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物与仪器试剂 30只8周龄雄性Wistar大鼠（200～250 g）购自西安交通大学医学部实验动物中心；气体浓度控制器购自上海塔望智能科技有限公司；H7650透射电子显微镜（日本日立）；721型分光光度仪（上海第三分析仪器厂）；荧光酶标仪（瑞士Tecan公司）；半干转膜仪（美国Hoefer公司）；手术器械（西安交通大学试剂中心）；高质纯化线粒体分离试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司）；组织蛋白裂解液（武汉博士德生物工程有限公司）；线粒体膜电位检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；细胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）活性测定试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司）；4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA，ERS 抑制剂，美国Sigma 公司）；抗葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）兔多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司（bs-1219R）；抗CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）兔多克隆抗体购自美国Sigma公司（SAB5700602）；常规试剂均为国产分析纯产品。

1.2 实验分组 动物饲养和处置均符合我国《实验动物管理条例》的要求，30 只雄性Wistar 大鼠平均分配到6 笼进行适应性饲养，7 d 后，按随机数字表法将其分为3组：（1）对照组大鼠10只，暴露在空气中喂养；（2）低氧组大鼠10 只，每天固定8 h 在（10±0.5）%的氧浓度下喂养，笼内氧浓度由气体浓度控制器（上海塔望智能科技有限公司）控制，其余16 h在空气中喂养；（3）干预组大鼠10只，喂养方式同低氧组，每天给予0.5 mg/kg 4-PBA混悬液灌胃。对照组和低氧组大鼠每天给予等体积生理盐水灌胃。3组大鼠均喂养21 d，并称重记录。

1.3 组织取材 用10%医用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，然后将其固定于试验台上。沿肋弓剪开皮肤及深层腹壁，而后纵行剪开左侧肋骨，暴露心脏，在主动脉根部水平剪断分离心脏，并迅速用4 ℃PBS溶液冲洗心腔内血液至澄清。在冰面上进行心脏各部分分离操作，首先修剪去除心包组织和脂肪组织，然后分别分离心房、右心室（RV）、左心室和室间隔（LV+S），用滤纸吸干后分别称重。用手术刀切取部分右心室组织置于2.5%戊二醛溶液固定，用于制作电镜标本，部分右心室组织用于提取线粒体并检测线粒体膜电位、呼吸链酶复合物活性，剩余组织均置于液氮罐中速冻，后转移到-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.4 组织病理学检查 将右心室组织标本放置在2.5%戊二醛溶液于4 ℃冰箱过夜，按照电镜超薄切片制作方法进行脱水、包埋、切片，在透射电子显微镜下观察细胞及线粒体结构。

1.5 线粒体提取 称取0.5 g左右新鲜右心室组织用于提取线粒体并检测线粒体膜电位和呼吸链复合物活性。根据线粒体提取试剂盒说明书在冰上完成操作，首先用眼科剪将组织剪碎，用PBS 溶液冲洗后转移到5 mL EP 管，加入2.5 mL 酶解液后冰上孵育10 min，低温离心机1 000 g离心2 min，弃上清后分别加入1.5 mL 清理液和1 mL 净化液，震荡混匀后再次离心弃上清，加入2.5 mL裂解工作液并转移到玻璃匀浆器中进行匀浆操作30～40 次，再次于低温离心机以1 200 g离心10 min，转移上清液到新的EP管，最后使用低温超高速离心机10 000 g离心10 min，弃上清后所得沉淀物即为新鲜的心肌组织线粒体混悬液，加入0.2 mL预冷的保存液轻柔吹打重新悬浮线粒体，随即开始检测线粒体膜电位和呼吸链酶复合物活性。

1.6 线粒体功能检测 在避光环境下使用JC-1 荧光探针用于检测线粒体膜电位，向新鲜提取的线粒体混悬液中加入0.1 mL JC-1染色工作液，摇匀后置入37 ℃水浴箱孵育20 min，随后离心弃上清，使用0.2 mL染色缓冲液洗涤细胞2次，每次10 min，最后加入0.2 mL染色缓冲液并悬浮线粒体，使用荧光酶标仪检测荧光强度（设定激发波长525 nm，发射波长590 nm）。根据SDH活性测定试剂盒说明书进行操作，首先制备反应底物并在37 ℃水浴箱内避光孵育5 min，取0.1 mL 新鲜提取线粒体加入反应底物中，分别在5 s和65 s时读取600 nm处吸光度值，其差值代表琥珀酸脱氢酶活性。根据COX 活性测定试剂盒说明书操作，设置分光光度仪25 ℃，将0.93 mL缓冲液加入比色皿，加入20 μL 新鲜提取的线粒体混悬液，37 ℃孵育3 min 后放入分光光度仪，加入50 μL 反应工作液并混匀，随机计时，在反应第0 秒和60 秒分别读取550 nm 处吸光值，其差值代表COX活性。

1.7 Western blotting 检测 称取100 g 右心室心肌组织在冰上剪碎，转移到研钵进行研磨，再转移到EP 管中，加入含1%苯甲基磺酰氟的裂解液1 mL，于冰上裂解30 min。裂解结束后于低温离心机6 500 g 离心20 min，取上清液用Bradford 法进行蛋白定量，加入相应量的上样缓冲液，在PCR 仪上95 ℃加热5 min 使蛋白质变性。取等质量蛋白经SDS-PAGE 电泳分离后转移至PVDF 膜，用含10%脱脂奶粉的PBST室温下封闭2 h，随后分别用1∶1 000稀释后的GRP78抗体和1∶2 000稀释后的CHOP抗体4 ℃冰箱孵育过夜，用1∶20 000稀释的HRP标记二抗37 ℃摇床孵育2 h。使用ECL发光试剂盒进行显色，将经过显影和定影后的X 光胶片晾干保存，统一用凝胶电泳成像分析系统照相，用Image Plus Pro图像处理软件进行灰度分析。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，各组数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心脏右心室质量占比变化 缺氧组大鼠在常压间歇缺氧环境下饲养21 d过程中，逐渐出现活动减少，进食量减少及生长缓慢等表现，至饲养第21 天时，缺氧组大鼠心脏体质比（心脏质量/体重）、右心室体质比（右心室质量/体重）和右心室占比[右心室质量/左心室+室间隔质量之和，RV/（LV+S）]均高于对照组（均P＜0.001），见图1。提示缺氧组大鼠出现以右心室肥大为主的心脏肥大表现，证实慢性缺氧诱发的慢性肺源性心脏病模型成功建立。

与缺氧组大鼠相比，干预组大鼠活动量、进食量有所增加，生长缓慢现象有所缓解，至饲养第21 天时，干预组大鼠心脏体质比、右心室体质比和RV/（LV+S）均低于缺氧组，其中以右心室质量及右心室体质比降低最为显著（均P＜0.05），见图1。提示4-PBA 干预可以有效防治慢性缺氧刺激诱发的慢性肺源性心脏病。

图1 慢性缺氧时大鼠心脏形态变化及4-PBA的干预作用

2.2 大鼠右心室心肌组织线粒体结构变化 慢性缺氧刺激下，缺氧组大鼠心肌线粒体出现肿胀变形，线粒体嵴排列紊乱，部分线粒体膜破坏，线粒体结构完整性丧失。干预组大鼠心肌线粒体结构异常相对较轻，线粒体结构完整性良好，未见线粒体膜破坏，见图2。

图2 慢性缺氧时大鼠心肌线粒体形态变化及4-PBA 的干预作用（×5 000）

2.3 大鼠右心室心肌线粒体膜电位及呼吸链酶复合物活性变化 与对照组相比，缺氧组大鼠心肌线粒体膜电位水平降低，线粒体呼吸链中COX 和SDH 酶相对活性均降低（均P＜0.001），见图3。与缺氧组相比，干预组大鼠心肌线粒体膜电位水平及COX、SDH 酶相对活性均有所升高（均P＜0.001），见图3。

图3 慢性缺氧时心肌线粒体功能变化及4-PBA的干预作用

2.4 大鼠右心室心肌ERS 相关蛋白表达变化 与对照组比较，缺氧组大鼠心肌组织ERS 相关蛋白CHOP、GRP78 表达水平上调（均P＜0.001），而4-PBA干预后，干预组CHOP、GRP78表达水平低于缺氧组（均P＜0.001），见图4。提示慢性缺氧刺激可诱发心肌组织ERS，同步给予4-PBA 可有效降低ERS水平。

图4 慢性缺氧时ERS相关蛋白表达水平的变化及4-PBA的干预作用

3 讨论

心脏是一个对氧气高度依赖的器官，任何引起机体系统性缺氧的疾病都可能导致心肌组织慢性缺氧，继而引发心肌收缩功能降低，甚至心力衰竭。因此，探寻慢性缺氧情况下心肌细胞功能变化的机制将为临床上救治慢性肺源性心脏病等缺氧性心脏病提供新的突破点。

线粒体是维持心肌细胞能量供应的重要细胞器，在慢性缺氧情况下，线粒体首先做出代偿性反应。慢性缺氧刺激通过活化氧敏感性转录因子上调线粒体相关生物合成，通过增加线粒体数量和增强线粒体呼吸功能的方式，保证线粒体的能量产出，维持心肌组织功能。同时，慢性缺氧刺激心肌细胞产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），上调蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）活性，继而诱导心肌线粒体耐受钙超载，抑制线粒体通透性转换孔开放，促进线粒体自噬，防止心肌细胞凋亡。然而，随着缺氧时间的延长，ROS 积累将诱发氧化应激损伤，通过介导线粒体损伤，促进钙离子和细胞色素C的释放，最终导致细胞凋亡[14]。

内质网是心肌细胞中除线粒体外的另一个重要细胞器，主要参与细胞内蛋白质合成、钙稳态和凋亡的调节。由于线粒体和内质网在调节细胞内钙稳态和细胞凋亡方面有诸多功能重叠，线粒体－内质网交互作用也逐渐被揭示且已经被证实参与包括炎症性疾病、肿瘤等多种疾病的发生过程。包括缺血缺氧、氧化应激等在内的应激刺激可诱发内质网折叠蛋白质过程紊乱，同时出现钙平稳紊乱和未折叠蛋白反应，即ERS。ERS发生后，内质网膜上的转录激活因子6（activating transcription factor，ATF-6）、IRE1（inositol-requiring enzyme 1）和PERK（protein kinase R-like ER kinase）分别活化，介导线粒体损伤及细胞凋亡[15]。此外，线粒体－内质网结构耦联（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM）也为两者之间钙离子转运、信号转导等交互影响提供物理作用平台[16]。尽管如此，ERS在慢性缺氧刺激导致心肌细胞线粒体结构和功能异常中所发挥的作用仍未有研究证实，以阻断ERS为靶点，是否可作为慢性肺源性心脏病的潜在治疗方法也需动物实验来揭示。

本研究通过常压间歇缺氧法构建慢性肺源性心脏病大鼠模型，结果发现，在肺心病大鼠出现右心室肥大的同时，右心室心肌细胞线粒体膜电位降低，呼吸链酶复合物中的关键酶COX、SDH 活性均降低，继而出现线粒体嵴结构排列紊乱、线粒体膜完整性破坏、线粒体肿胀等结构异常。在肺心病大鼠出现心肌组织线粒体结构和功能异常的同时，ERS 标志性蛋白CHOP 及GRP78 表达水平上调（P＜0.001），提示ERS 与线粒体受损同时出现。为了进一步明确ERS与线粒体损伤之间的相互关系，本研究结果结果发现，4-PBA 在抑制ERS 的同时，可以有效地发挥线粒体保护作用，4-PBA 干预大鼠在慢性缺氧环境中线粒体膜电位下降得到改善，线粒体呼吸链酶复合物活性有所升高，电镜下还可以观察到线粒体结构破坏程度有所缓解，并最终减轻了慢性缺氧导致的右心室肥大。

由此可见，ERS 可能作为线粒体损伤的上游机制参与慢性缺氧诱发慢性肺源性心脏病的发病过程，而且以ERS为作用靶点可以有效减轻慢性缺氧诱发的线粒体损伤和右心室肥大。在阿尔茨海默病、帕金森病等多种疾病模型研究中，线粒体一直被认为在线粒体和内质网交互作用中发挥主体作用，即多种应激刺激引起线粒体产生ROS 增多，通过氧化应激诱使线粒体结构及功能异常，从而激活ERS，最终通过未折叠蛋白反应和钙稳态失衡影响细胞功能状态[17-18]。然而，ERS发生后，内质网中储存的大量钙离子释放进入细胞质，可引发线粒体膜通透性转换孔开放，引发线粒体肿胀，细胞色素C释放入细胞质，激活线粒体途径细胞凋亡[19-20]。此外，ERS下游信号通路中的caspase-12活化后可以通过MAM 上内质网蛋白GRP78 与线粒体蛋白VDAC1调节线粒体介导的细胞凋亡[21-22]。

综上所述，本研究通过动物实验揭示了慢性缺氧可诱发心肌细胞ERS，继而引起线粒体功能损伤和结构异常，参与慢性肺源性心脏病的发病过程。明确ERS 介导的线粒体损伤在慢性肺源性心脏病中的作用有助于阐明慢性肺源性心脏病的发病机制，并证实靶向ERS的药物可以应用于以心肌细胞保护为策略的慢性肺源性心脏病治疗中。