lncRNA SNHG1调控PI3K/AKT/NF-κB信号通路对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响*

杨 涛，李小玲，阳承艳，李洋洁，王丽娜，陈润奇

（广西桂林市人民医院重症医学科，桂林 541002）

急性心肌梗死（AMI）是危害人类健康及生命的心血管疾病之一[1]。溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是治疗AMI的有效方法[2]。然而，遭受一定时间缺血的组织细胞恢复血流（再灌注）后，组织损伤反而加重，甚至发生不可逆损伤，这一过程称为心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）[3]。MIRI 严重影响缺血性心脏疾病患者的预后，且其机制复杂多样，主要包括钙超载、炎症、氧化应激和线粒体功能障碍[4-7]。因此，明确MIRI发病机制、探索新的治疗靶点对AMI的治疗及预后具有重要意义。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类真核生物中长度大于200 nt的非编码RNA分子，它们本身不编码蛋白，而是以RNA 的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平[8]。近年来研究发现，lncRNA 在肿瘤、神经疾病、心血管疾病的发生和发展过程中发挥重要的生物学功能[9]。小核RNA宿主基因1（SNHG1）是由11 号染色体上作为18s 核糖体RNA 重要组成部分的UHG 基因转录而来的lncRNA。研究显示，敲除lncRNA SNHG1可抑制过氧化氢（H2O2）诱导的心肌细胞凋亡[10]。抑制SNHG1 可促进心肌细胞增殖和血管生成，降低心肌梗死后心肌细胞凋亡，改善心功能[11]。但lncRNA SNHG1 在MIRI 中的作用及机制尚不清楚。本研究旨在探讨下调lncRNA SNHG1表达对MIRI小鼠心肌细胞凋亡的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级10～12 周龄C57BL/6J 小鼠18 只，体重20～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SYXK（京）2019-0010。小鼠分笼饲养，自由摄食、饮水，饲养环境温度（25±2）℃，湿度40%～70%。本实验动物处置符合动物伦理学要求。

1.2 实验分组 将18只小鼠随机分为3组，分别为假手术（Sham）组、MIRI组、SNHG1小干扰RNA（si-SNHG1）组，每组6 只。si-SNHG1 组小鼠通过左前胸壁小切口暴露心脏，将100µL 携带si-SNHG1 的腺病毒（滴度为1.0×109pfu/只，由广州瑞博生物公司提供）从左室心尖部向主动脉根部注射，主动脉和肺动脉交叉钳夹20 s。排出空气和血液后，关闭胸腔。注射腺病毒5 d后建立MIRI模型。

1.3 MIRI小鼠模型的建立 用2.5%戊巴比妥麻醉小鼠，仰卧固定于小动物手术台上，连接心电图，行气管插管后连接HX-300S 动物呼吸机，潮气量250 mL/min，呼吸频率120 次/min。沿胸骨左缘第3、4 肋间开胸，打开心包，于左心耳下方2 mm 处穿丝线结扎左冠状动脉前降支。观察小鼠心电图变化，以ST 段抬高作为判断结扎成功的标准。结扎45 min 后松开结扎线，恢复心肌血流供应，再灌注2 h。Sham组仅开胸不结扎。

1.4 心功能检测 再灌注2 h后，应用MyLab 30CV超声系统及10 MHz 线性超声换能器，对各组小鼠进行心脏超声检查。麻醉后将小鼠置于加热垫上并取左侧卧位，用刮毛刀刮除胸部毛发，测量射血分数（EF）、左室短轴缩短率（FS）和心率。由两位实验室技术员双盲法操作，取两者均数。

1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测心肌组织SNHG1表达 Trizon法提取总RNA，测定RNA 纯度和浓度，逆转录为cDNA，行PCR 扩增。PCR 反应体系：2×ULtraRT one step Buffer 12.5 μL，RNA 1 μg，上、下游引物各1 μL，ULtraRT one step EnzymeMix 0.5 μL，加入无RNA 酶的双蒸水至25 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环。引物序列如下：SNHG1上游：5’-CCTAAAGCCACGCTTCTTG-3’，下游：5’-TGCAGGCTGGAGATCCTACT-3’；GAPDH上游：5’-ACCCAGAAGACTGTGGAGG-3’，下游：5’-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3’。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算SNHG1mRNA相对表达量。

1.6 心肌病理学观察 心功能检测后将小鼠深度麻醉处死，迅速取出心脏，切下部分心肌组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h，脱水，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，行苏木精—伊红（HE）染色。光学显微镜下观察心肌组织病变情况并拍照。

1.7 2,3,5-三苯基四唑氯化（TTC）染色检测心肌梗死面积 取新鲜心肌组织，去除心房和大血管，冰PBS 清洗，滤纸吸干水分，置于-20 ℃冰箱中冷冻30 min 后，自心尖起每隔2 mm 垂直于心脏长轴将心脏切成薄片。置于1%TTC溶液（Sigma-Aldrich，美国）中，37 ℃水浴20 min。完成染色后，将心肌薄片置于显微镜下（放大10 倍）观察，拍照。利用Image J 软件测量左心室面积（LV）、缺血面积（AAR，TTC 染为砖红色）和梗死面积（IS，TTC 染色呈灰白色）。梗死面积（%）=IS/AAR×100%。

1.8 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡 将心肌组织切片放在60 ℃烤箱中烘烤30 min，二甲苯脱蜡，乙醇脱水，蛋白激酶K 孵化30 min；PBS 冲洗后，加入TdT和Lucifase标记的dUTP，37 ℃下反应1 h；用二氨基联苯胺（DAB）作为底物反应10 min，然后用苏木精进行核染色，在荧光显微镜下拍照、计数。凋亡细胞核为棕黄色，正常细胞核呈蓝色。

1.9 Western blotting 法检测Cleaved caspase-3 和PI3K/AKT/NF-κB蛋白表达 心肌组织中加入蛋白裂解液（含PMSF），于冰上裂解，BCA法测定蛋白浓度；SDS-PAGE 电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上；加入一抗PI3K（1∶200）、磷酸化（p-）PI3K-p85（1∶300）、AKT（1∶300）、p-AKTser473（1∶300）（Affinity Biosciences，美国）和Cleaved caspase-3（1∶200）、NFκB（1∶300）、p-NF-κB-p65（1∶300）、GAPDH（1∶1 000）（Cell Signaling Technology，美国）4 ℃孵育过夜，TBST 漂洗3 次，每次10 min；加入HRP 山羊抗兔IgG二抗（1:10 000，Cell Signaling Technology，美国）37 ℃下孵育1 h，TBST 漂洗3 次，每次10 min。采用ECL 化学发光法显示蛋白条带，Image-Pro Plus 6.0进行灰度分析。

1.10 统计学方法 所有数据均采用SPSS 26.0 统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠心肌组织中lncRNASNHG1表达水平比较 与Sham 组比较，MIRI 组lncRNASNHG1相对表达量升高（P＜0.05）；与MIRI 组比较，si-SNHG1组lncRNASNHG1相对表达量降低（P＜0.05），见图1。

图1 各组小鼠心肌组织中lncRNA SNHG1表达水平比较

2.2 lncRNA SNHG1 表达下调对MIRI 小鼠心功能的影响 3 组小鼠心率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与Sham组比较，MIRI组小鼠心室扩大，心壁变薄，下调SNHG1 可改善MIRI 诱导的小鼠心室壁结构异常变化；MIRI 组小鼠EF%和FS%较Sham 组下降（P＜0.05）；与MIRI 组比较，si-SNHG1组FS%和EF%升高（P＜0.05），见图2。

图2 各组小鼠心功能指标比较

2.3 lncRNA SNHG1 表达下调对MIRI 小鼠心肌梗死面积的影响 MIRI 组小鼠心肌梗死面积大于Sham 组（P＜0.01）；与MIRI 组比较，si-SNHG1 组小鼠心肌梗死面积减小（P＜0.01），见图3。

图3 各组心肌梗死面积比较

2.4 lncRNA SNHG1 基因下调对MIRI 小鼠心肌病理损伤的影响 Sham组心肌细胞横纹和闰盘清晰，心肌纤维结构清晰，排列完整紧密，染色均匀，细胞核完好，无细胞坏死现象；MIRI组组织结构不连续，细胞排列紊乱，细胞核溶解和皱缩明显，心肌纤维撕裂，细胞核深染；si-SNHG1组心肌细胞排列较为完整，坏死细胞减少，见图4。

图4 各组心肌组织HE染色图（×400）

2.5 LncRNA SNHG1对MIRI小鼠心肌细胞凋亡的影响 与Sham 组比较，MIRI 组心肌细胞凋亡率升高（P＜0.01）；与MIRI 组比较，si-SNHG1 组心肌细胞凋亡率降低（P＜0.01），见图5。

图5 各组心肌细胞凋亡率比较（×200，比例尺=25 μm）

2.6 LncRNA SNHG1对小鼠心肌组织Cleaved caspase-3 蛋白表达的影响 与Sham 组比较，MIRI 组Cleaved caspase-3 蛋白表达上调（P＜0.001）；与MIRI组比较，si-SNHG1组Cleaved caspase-3蛋白表达下调（P＜0.001），见图6。

图6 LncRNA SNHG1对小鼠心肌组织凋亡相关基因表达的影响

2.7 各组PI3K/AKT/NF-κB 信号通路蛋白表达比较 3 组间心肌组织PI3K 和AKT 蛋白表达水平无明显差异（P＞0.05）。与Sham 组比较，MIRI 组p-PI3K和p-AKT表达水平降低，NF-κB蛋白表达升高（P＜0.05）；与MIRI 组比较，si-SNHG1 组p-PI3K 和p-AKT表达水平升高，而NF-κB蛋白表达降低（P＜0.05），见图7。

图7 各组PI3K/AKT/NF-κB信号通路蛋白表达比较

3 讨论

本研究结果显示，MIRI 组SNHG1 表达水平升高，心肌组织损伤程度和梗死面积增加，si-SNHG1组小鼠心肌SNHG1 表达降低，心肌损伤程度和梗死面积明显减小。TUNEL 染色结果显示，si-SNHG1 逆转了MIRI 对心肌细胞凋亡的促进作用，并明显下调心肌组织中凋亡蛋白Cleaved caspase-3表达。提示SNHG1表达水平与MIRI引起的心肌细胞凋亡和心脏功能损伤相关。

在MIRI 过程中涉及到多种信号通路，其中PI3K/AKT 通路在减轻MIRI 中发挥重要作用，该通路持续激活可抑制缺血性损伤诱导的细胞凋亡[12]。PI3K是一种具有丝/苏氨酸激酶活性的细胞内磷脂酰肌醇激酶，由二聚体、调节亚基（p85）和催化亚基（p110）组成。生理状态下，AKT 以失活状态存在，当受到外界刺激时，激活的PI3K 可引起AKT 的Ser47和Thr308残基发生磷酸化，AKT激活。此外，炎症反应亦是MIRI 的重要病理生理过程，心肌细胞凋亡和炎症反应与NF-κB 通路的激活密切相关[13]。NF-κB 是AKT 的重要下游元素，PI3K/AKT通路主要通过抑制下游转录因子NF-κB 来调控细胞凋亡进程。Luan 等[12]报道，PI3K/AKT 激活可抑制NF-κB表达，减轻MIRI诱导的心肌损伤，抑制心肌细胞凋亡和炎症反应。此外，lncRNA 对心肌细胞的凋亡调控也发挥了重要的作用。研究发现，抑制lncRNA Gpr19可通过miR-324-5p/Mtf1轴抑制心肌细胞凋亡和氧化应激，从而减轻AMI后的再灌注损伤[14]。抑制lncRNA SNHG1 亦能减弱H2O2对心肌细胞活性和凋亡的影响[10]。本研究结果显示，siRNA 干扰SNHG1 表达可显著上调心肌组织中PI3K/AKT 磷酸化水平，并抑制NF-κB 蛋白表达。提示干扰lncRNA SNHG1 表达可能通过激活PI3K/AKT 信号通路，抑制NF-κB 表达，减少心肌细胞凋亡，缩小心梗面积，改善心功能。

综上，干扰lncRNA SNHG1 表达可以通过激活PI3K/AKT 并抑制NF-κB 信号转导，抑制心肌细胞凋亡显著减轻MIRI诱导的心肌损伤。SNHG1可能是MIRI治疗的潜在靶点。