三种牙膏配方的防腐挑战实验

2022-08-22邢丛衍陈玉玲

口腔护理用品工业 2022年4期

邢丛衍陈玉玲

(云南诺特金参口腔护理用品有限公司云南昆明 650212)

引言

在牙膏监管越来越严的今天，添加中药提取物、草本成分的牙膏越来越多，但植物类提取物质量控制较难，特别是微生物经常超标。为了更好地了解牙膏成品的微生物警戒线，防腐挑战试验是比较直观有效的方法。但牙膏还没有专门的防腐体系检测和评价标准，只能参考现行的化妆品防腐挑战试验进行改进，再完成牙膏的防腐试验方法。对于试验方法设计的难点在于代表性牙膏类型、培养基、中和剂、自选菌种的选择，防止培养基的不适应、假阴性等造成结果的误差，试验前需先做好相关验证工作，本研究不讨论试验前验证工作。

选用苯甲酸钠为防腐剂是因为在牙膏中的应用已经比较成熟，一般添加量在0.2%～0.5%，其防腐效能受pH值影响较大，杀菌和抑菌效力随介质的酸度增高而增强，不适合用于碳酸钙牙膏[1]。

经常年牙膏用中药提取物的检测，其带菌量比较大，液体提取物中微生物繁殖快，在检测中发现有芽孢存在。经过SN/T 0178-2011嗜热菌芽孢标准和SN/T 2206.2-2009需氧芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌标准的检测和验证，证明大多数提取物带菌为革兰氏阳性蜡样芽孢杆菌，兼性厌氧。其形态为白蜡状，表面扁平、不规则、带有光泽的近似圆形质地柔软的菌毯，挑起来呈现丝状，有很强的蔓延能力，对外界有害因子抵抗力强，会产生防御性内芽孢[2]。特选取蜡样芽孢杆菌通过GB/T 4789.14-2014分离、纯化，为自选菌种。

1 实验材料

1.1 实验试剂

卵磷脂-吐温80营养琼脂培养基、SDA培养基、营养琼脂培养基、TSA培养基、SCDLP液体培养基(培养基均为北京三药)、生理盐水。

1.2 实验菌种

菌种：黑曲霉CMCC(F)98003、大肠埃希氏菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、白色假丝酵母菌ATCC10231。广东环凯微生物科技有限公司制造。

自选菌种：蜡样芽孢杆菌。

1.3 实验用牙膏

防腐剂均为苯甲酸钠，用量均为0.2%，基础配方中发泡剂均为十二烷基硫酸钠，增稠剂均为CMC、黄原胶，保湿剂、香精、甜味剂等均一致。样品无菌，不含氟。

样品1：磷酸氢钙与二氧化硅复配。

样品2：二氧化硅透明儿童牙膏。

样品3：功效牙膏，磷酸氢钙，含中药提取物。

1.4 中和剂选择

依据《T/SHRH 017-2019》附录B常见中和剂参考表，苯甲酸类防腐剂无对应中和剂。但存在K12等表活性物质，牙膏又属于亲水性膏体，培养基里已有卵磷脂和吐温80，所以不再添加中和剂。

2 实验步骤

2.1 菌种复苏和传代

菌种：用注射器全部吸出配套的复苏液，再注入冻干菌种所在的瓶内，摇匀，吸取100微升菌液于培养皿中，细菌接种于营养琼脂培养基，置于培养箱36℃±1℃培养48h，真菌、酵母接种于SDA培养基，置于培养箱28℃±2℃培养2～5天。

将复苏后菌种传代至第3代，细菌传代培养基使用TSA，真菌、酵母使用SDA培养基，传代培养条件与复苏条件相同。

2.2 菌种悬浊液制备

将第3代菌种培养与于试管斜面，用10ml无菌生理盐水冲洗菌苔至单独的无菌试管中摇匀，细菌、真菌分别等比例混合，自选菌种单独使用。

菌量选用：CTFA推荐量为霉菌10000CFU/ml，细菌1000000CFU/ml。

T/SHRH 017-2019中国团体标准为108CFU/ml。

2.3 试验方法

依照不同标准有不同的方法，在此选用一次加菌28天试验，同时监控pH数值。根据微生物数量变化来评价产品的防腐效果。

2.4 试验步骤

3种样品各取300g，每个样品平均分装于3个无菌锥形瓶中并编号，每个瓶中加入1种菌悬液1ml搅拌均匀，加了蜡样芽孢杆菌、细菌悬浊液试样培养在36℃±1℃，真菌、酵母悬浊液试样培养在28℃±2℃。在试验的第0、3、7、14、21、28天取样试验；使用含无菌玻璃球的90ml生理盐水的锥形瓶，称取10g样品搅拌均匀，做8个稀释度，每个稀释度做平行样，每次试验的第一个稀释度取10ml置于90ml已灭菌的SCDLP中观察是否出现假阴性，细菌使用卵磷脂-吐温80营养琼脂培养基，真菌、酵母使用SDA培养基。计数按照《化妆品安全技术规范》(2015版)第五章进行。

2.5 评价方法选择

根据不同的标准，目前有3种评价方法见表1。

表1 CTFA所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准

表2 T/SHRH 017-2019，T/GDCDC 010-2019防腐效果评价标准

防腐效果可以以菌落数的对数减少值(RX)作为评价指标。

计算方式见式(1)。

RX =lgNO-lgNX

(1)

式中：NO——菌液在样品中的初始浓度；

NX——样品在不同检测时间的菌落数。

表3 国内参照CTFA加菌防腐挑战性评价标准

其中表1、3相似，所以选择CTFA一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准，和中国团体防腐效果评价标准进行评价和对比。

3 结果与评价

3.1实验结果

选用中国团体标准的结果(见表4、表5、表6)。

表4 细菌检测数据表

表5 自选菌检测数据表

表6 真菌、酵母检测数据表

pH值变化见表7。

表7 pH值检测数据表

从表中可以看出细菌、真菌、酵母混悬液在刚加入时，防腐剂就开始起效，牙膏pH值也在逐步降低，细菌在第21天以后，真菌、酵母在第14天以后可以保持不大于10cfu/g，在以上3种牙膏类型中苯甲酸钠防腐剂效果无太大偏差，对不同配方体系的影响不大。对于蜡样芽孢杆菌，其能在牙膏中呈现增殖和自然减少的规律，可见苯甲酸钠防腐剂和牙膏体系对其无任何防腐效果。

选用CTFA菌种浓度的所有样品的结果为，霉菌第0～28天全未检出，细菌第3～28天为0cfu/g，通过SCDLP培养后无假阴性存在，蜡样芽孢杆菌第0～28天仍然存在104cfu/g。