新疆野苹果AP2/ERF转录因子家族鉴定与响应腐烂病的表达分析

赵明奇，刘晓洁，梁玉青，杨瑞瑞，李小双,3*

(1 新疆抗逆植物基因资源保育与利用重点实验室，乌鲁木齐 830011；2 中国科学院 吐鲁番沙漠植物园，新疆吐鲁番 838008；3 中国科学院大学，北京 100049)

在植物中转录因子参与诸多信号转导过程，调控其生长发育和逆境胁迫响应[1-3]。到目前为止，在植物体内至少鉴定到58类转录因子家族[4-6]。AP2/ERF(APETALA2 and ethylene responsive element binding proteins)转录因子家族是植物中数量最多的转录因子家族之一[7]。该转录因子家族的共同特征为均含有AP2保守结构域，该结构域由4个二级蛋白结构构成，包括3个β折叠和1个α螺旋。根据AP2/ERF转录因子家族经典分类法[8]，即保守结构域的数量和种类，将AP2/ERF转录因子家族分为5个亚家族，包括AP2、DREB、ERF、RAV和Soloist，其中AP2亚家族一般含有2个AP2结构域，DREB和ERF亚家族含有1个AP2结构域，RAV亚家族含有一个AP2和一个B3 domain，Soloist也只含有一个AP2结构域，但与其他亚家族进化距离较远，单独为一个亚家族[9-10]。许多AP2/ERF类转录因子在植物生长发育和逆境响应信号转导过程中处于分子调控网络的关键节点[11]。AP2/ERF转录因子首次在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中被鉴定和分离(AP2亚家族)，主要参与调控植物的生长发育[12]；随后又在烟草(Nicotianatabacum)中鉴定到了与乙烯响应元件结合的ERF转录因子，主要在植物抵抗生物胁迫过程中发挥作用[13]；后续通过干旱和低温胁迫在拟南芥中分离出DREB转录因子(DREB1和DREB2)[14]；较为相似的ERF和DREB根据保守结构域的序列比对发现内部的第14位和第19位氨基酸是区分ERF与DREB两个亚家族的关键位点，分别为丙氨酸、天冬氨酸(A14、D19)和缬氨酸、谷氨酸(V14、E19)[8]；RAV和Soloist亚家族成员的首次发现同样是在拟南芥中(RAV1和RAV2)，其中RAV亚家族广泛参与多类生物进程，而Soloist响应植物激素水杨酸的抗病过程[15-16]。在模式植物拟南芥中，AP2/ERF家族共有175个成员，其中AP2亚家族31个，ERF亚家族77个，DREB亚家族57个，RAV亚家族7个，Soloist亚家族3个。

新疆野苹果(Malussieversii)，又名塞威氏苹果，主要分布在中亚地区的天山山脉[17],在中国境内则集中分布在新疆伊犁的新源、霍城、巩留及裕民等地[18]。新疆野苹果受生存环境影响，能耐受低温[19]、高温[20]和干旱环境[21-23]，且具有抵抗多种病原菌引起的果木病害的能力，如苹果火疫病(fire blight)[24]和青霉病(blue mold)[25-27]。随着基因组学的发展，有研究表明新疆野苹果是现代栽培苹果(Malusdomestica)的祖先，具有重要的科研和保护价值[28-29]。但近年来新疆野苹果种群分布面积不断减少，已被列为国家濒危二级保护植物[30]。最近研究表明人为干扰、苹果小吉丁虫(Agrilusmali)和苹果腐烂病(Valsacanker)直接导致了新疆野苹果大面积集中死亡[31]，因此保护新疆野苹果种群的研究刻不容缓。

苹果腐烂病不仅是天山野果林中新疆野苹果的主要病害，也是中国乃至世界栽培苹果的主要病害之一。苹果腐烂病是一种由黑腐皮壳菌(Valsamali)侵染所致的严重的真菌型果树病害，主要发病于树干皮层、韧皮部和木质部，造成腐烂坏死[32]。苹果腐烂病是中国各主要苹果产区普遍发生且危害严重的一种枝干型病害[33]，可使苹果树势衰弱、产量降低，严重至树枝枯死或全树死亡[34]。目前，苹果腐烂病的防治主要采用人工刮治和化学防治结合的方法，但存在一定问题，如费工费时和污染环境。新疆野苹果是世界栽培苹果的祖先种，具有较高的遗传多样性和丰富优良的基因资源，在原始生境中表现出抵抗多种胁迫的良好适应能力，可为世界栽培苹果的新种质创制和培育提供基因资源。AP2/ERF家族中不同的亚家族均能够参与和响应不同的生物和非生物胁迫过程，是植物胁迫响应最为关键的转录因子家族之一[35]，本研究基于已获得的新疆野苹果响应腐烂病病原菌侵染的全长转录组数据，对新疆野苹果AP2/ERF基因家族进行鉴定、分类、表达模式分析以及验证。通过对新疆野苹果抗性基因资源的鉴定和挖掘，为新疆野苹果腐烂病的防治研究建立坚实的理论基础，也为栽培苹果抗性分子育种提供候选基因。

1 材料和方法

1.1 数据源及材料处理

1.1.1 转录组数据本研究基于新疆野苹果响应腐烂病病原菌侵染全长转录组数据(PRJNA687214)[36]，对MsAP2/ERF转录因子基因家族进行鉴定与研究。

1.1.2 植物材料与菌株qRT-PCR试验的植物材料为新疆野苹果组织培养1月龄幼苗[37]，用于接种腐烂病病原菌为本实验室保存的菌株EGI1(Valsamali)[38]。

1.1.3 实验处理与样本收集采用划布轮法对新疆野苹果组培苗整株进行接菌处理[39]，分别在感染后不同时间点(0、1、2和5 d)取样并进行液氮速冻保存，每个样本均为3个生物学重复。

1.2 MsAP2/ERFs转录因子鉴定

1.2.1 新疆野苹果AP2/ERF转录因子家族基因检索与鉴定从蛋白质数据库Pfam(http://pfam.xfam.org/)下载蛋白数据库文件Pfam-A，并搜索AP2/ERF转录因子家族的Pfam编号PF00847，利用生物信息学软件TBtools[40]进行HMM-search，从转录组数据库中检索出初步筛选蛋白序列。利用CD-hit软件包在Linux系统环境下去除冗余(一致性> 95%)。

1.2.2 新疆野苹果AP2/ERF转录因子鉴定新疆野苹果AP2/ERF转录因子保守结构域与保守motif分析利用NCBI-CDD batch(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)对筛选后的蛋白序列进行保守结构域的鉴定，利用在线motif分析网站MEME(http://meme-suite.org)进行保守motif的分析。

1.2.3 新疆野苹果AP2/ERF转录因子家族基因系统进化分析加入拟南芥AP2/ERF转录因子蛋白序列，用于新疆野苹果AP2/ERF转录因子家族系统进化分析。利用MEGA6.0软件对新疆野苹果AP2/ERF和拟南芥AP2/ERF保守结构域序列进行多重比对分析，使用相邻连接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，bootstrap设为1000。利用EvolView(https://www.evolgenius.info)对系统进化树进行编辑。拟南芥AP2/ERF转录因子家族数据来自于植物转录因子数据库PlantTFDB(planttfdb.gao-lab.org)。

1.3 新疆野苹果AP2/ERF转录因子蛋白质理化性质和亚细胞定位预测

利用在线工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)预测AP2/ERF转录因子的理化性质，包括蛋白质分子质量和等电点。利用BUSCA(http://busca.biocomp.unibo.it)对AP2/ERF转录因子的亚细胞定位进行预测。

1.4 新疆野苹果AP2/ERF差异表达转录因子筛选

使用转录组测定的基因差异表达数据，以Padj≤0.05，|log2Foldchange|≥1为标准进行AP2/ERF家族的差异基因筛选。

1.5 新疆野苹果AP2/ERF转录因子家族基因在腐烂病菌侵染胁迫下的基因表达模式分析

提取腐烂病病原菌侵染0、1、2和5 d后的新疆野苹果整株组培苗的总RNA，反转录为cDNA，利用荧光定量qRT-PCR进行目标基因相对表达量的测定。总RNA提取使用OMEGA bio-tec公司植物RNA提取试剂盒(R6827-01)；反转为cDNA过程使用宝日医生物技术(北京)有限公司生产的反转录反应试剂盒(RR047Q)；qRT-PCR定量使用宝日医生物技术(北京)有限公司生产的嵌合荧光法检测酶(定量试剂盒)(RR820Q)。定量引物使用Primer5软件进行设计，引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表1。qRT-PCR定量采用Bio-Rad CFX96型荧光定量PCR仪，反应程序设定：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，循环40次。以0 d做对照，用MsERF基因作为内参[35]，每个基因的相对表达量以平均值±标准差来显示，采用2-ΔΔCt计算[41]。所有基因在每个时间点的相对表达量为3个生物学重复和3个技术重复。基因相对表达量数据的显著性分析方法采用单因素方差分析和LSD多重检验。基于RNA-seq数据的差异表达基因的表达量分析使用每个时间点3个生物学重复的FPKM值进行计算。使用软件GraphPad Prism 9.0进行数据统计和分析作图。

表1 MsAP2/ERF实时荧光定量实验引物Table 1 qRT-PCR primers for MsAP2/ERF genes

2 结果与分析

2.1 MsAP2/ERF转录因子的鉴定及理化性质分析

本研究基于新疆野苹果响应腐烂病菌侵染全长转录组数据(PRJNA687214)[36]，使用生物信息学分析软件TBtools将转录组中的159 249条序列进行开放阅读框区域查找预测，基于最长开放阅读框原则输出氨基酸序列结果；EMBL-EBI网站下载pfam-A文件，使用TBtools中的HMM Search功能，输入AP2/ERF基因隐马可夫模型序号PF00847进行Hmmer-search，得到初筛结果206条序列；在Linux系统编译环境下，使用CD-hit软件包，以重复度95%为标准去冗余后，再去除保守结构域不完整序列，最终获得106个新疆野苹果AP2/ERF基因。

利用在线工具Expasy对新疆野苹果106个AP2/ERF转录因子进行基本理化性质预测，核酸长度在747～5 926 bp之间，氨基酸链长度在144～662 aa之间，蛋白质分子量大小在15.3～73.5 kD之间，等电点在4.66～11.81之间，其中等电点≥7.0以上的AP2/ERF家族成员有54个，<7.0以下的成员有52个。利用在线BUSCA工具进行蛋白质亚细胞定位预测，发现MsAP2/ERF蛋白主要定位在细胞核内(86%)，其余分别定位在叶绿体(10%)、线粒体(2%)、内膜系统(1%)和细胞间隙(1%)。

2.2 新疆野苹果AP2/ERF转录因子家族系统进化分析

将106个MsAP2/ERF预测蛋白序列与175个AtAP2/ERFs转录因子构建Neighbor-Joining(NJ)进化树，结果表明MsAP2/ERFs各亚家族成员可与AtAP2/ERFs各亚家族成员有规律地聚集，根据拟南芥的亚家族分类，将106个MsAP2/ERF转录因子成员分为5个亚家族(图1)，分别为AP2亚家族(17个)、ERF亚家族(57个)、DREB亚家族(25个)、RAV亚家族(5个)、Soloist亚家族(2个)。

2.3 新疆野苹果AP2/ERF家族蛋白保守结构域和保守基序分析

在本研究中，利用NCBI-CDD-Batch对AP2/ERF转录因子蛋白序列进行保守结构域分析,表明MsAP2/ERFs的保守结构域种类、数量与系统发育进化分析结果一致。此外，ERF亚家族B1组的成员MsERF04和MsERF05，不仅含有AP2结构域，且在C端具有TIR结构域(图2，a)。AP2/ERF转录因子不同亚家族之间不仅在保守结构域种类和数量上不同，在AP2保守结构域的氨基酸序列和组成上也不同。利用MEME进行结构域motif组成分析，共获得8个保守基序(图2，b、c)，结果表明所有MsAP2/ERFs转录因子均含有AP2保守结构域，但不同亚家族AP2结构域的motif组成有差异，如DREB中的AP2结构域由motif 1、motif 2和motif 3组成，RAV亚家族的AP2结构域主要由motif 1和motif 3组成。同时，不同亚家族含有特异性的motif，如motif 4在DREB亚家族中特异地存在，且分布紧邻AP2结构域；motif 6在ERF亚家族的B2组中特异地存在。

2.4 ERF/DREB亚家族成员鉴定与分析

ERF与DREB亚家族是AP2/ERF家族中数量最多、占比最大且在植物胁迫响应过程中发挥非常重要作用的亚家族。在本研究中，利用AtERF亚家族(86个)、AtDREB亚家族(45个)、MsERF亚家族(57个)和MsDREB亚家族(25个)进行系统发育树构建和进一步细化分类分析。系统进化分析结果显示新疆野苹果25个DREB亚家族中缺少A1和A3组；数量上主要以A6组为主，有21个成员；A2组、A4组和A5组分别有1、2和1个成员。57个MsERF亚家族成员包括齐全了6个组，数量上主要由B2、B3和B4为主，各组成员数量如下：B1组8个，B2组15个，B3组12个，B4组17个，B5组3个和B6组2个(图3)。

在本研究中，利用MsERFs和MsDREBs的AP2结构域序列进行多序列比对，结果表明新疆野苹果的AP2结构域氨基酸组成与拟南芥一致，3个β折叠区中，β1中的第2位至第6位是AP2结构域的保守氨基酸位点YRGV，β2区域存在AEIR 4个保守氨基酸位点，β3区域存在WLG 3个保守氨基酸位点(图4)。新疆野苹果和拟南芥的ERFs在第14位和19位两个保守位点氨基酸一致，均为A14和D19(图4)。MsDREBs和AtDREBs在第14位保守位点的氨基酸种类一致，均为缬氨酸(V14)，但拟南芥第19位氨基酸为谷氨酸(E19)，而新疆野苹果则为亮氨酸(L19)(图4)。

2.5 腐烂病诱导下新疆野苹果AP2/ERF转录因子的表达

基于RNA-seq数据，以|log2Foldchange|≥1，padj < 0.05为标准进行差异基因的筛选，从106个MsAP2/ERF基因中筛选出29个差异表达基因，其中MsERF亚家族成员19个，MsDREB亚家族成员4个，MsRAV亚家族成员3个，MsAP2亚家族成员2个，MsSoloist亚家族1个。MsERF亚家族差异表达基因主要分布在B1、B2、B3、B4等4个亚组，19个MsERF基因全部受腐烂病诱导上调表达，其表达模式可聚为3类：早期(1 d)上调表达、中期(2 d)上调表达和晚期(5 d)上调表达3种表达模式(图5，a)。MsAP2亚家族2个差异表达基因在响应腐烂病感染后均为下调表达；MsDREB亚家族成员2个基因为上调表达，2个为下调表达；差异表达RAV亚家族成员中，1个基因为上调表达，2个基因为下调表达(图5，b)。此外，RNA-seq的FPKM值数据显示，具有TIR保守结构域的两个ERF亚家族的基因表达量完全不同，其中MsERF05在4个时间点之间的表达量有明显差异，而MsERF04则几乎没有检测到表达(FPKM值为0)。因此，挑选12个受腐烂病诱导高表达或表达模式不同的差异表达基因，包含4个DREB和8个ERF基因进行了基因相对表达量的验证。结果(图6)显示，在腐烂病感染后1～5 dDREB亚家族A6组基因MsDREB05相对表达量均显著降低；其余3个基因的相对表达量在腐烂病感染5 d后显著升高。而ERF亚家族则在1或5 d显著上调，响应植物抵抗腐烂病过程(图6)。其中，B4类基因MsERF40在腐烂病感染5 d后相对表达量上调了138倍，以及含TIR结构域的MsERF05在腐烂病感染1 d后上调69倍(图6)。

3 讨 论

AP2/ERF作为植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育和逆境响应过程中发挥重要作用[35，42-44]。根据对拟南芥和水稻(Oryzasativa)中的AP2/ERF基因家族研究，已建立了AP2/ERF基因家族成员经典分类原则。首先根据成员所含保守结构域的类型(AP2和B3结构域)和数量来进行初步分类[8-9]，再根据与拟南芥或其他模式植物的AP2/ERF蛋白质序列共同构建系统发育树进行亚家族分类，该分类原则已在不同物种中被广泛使用[45-49]。本研究基于转录组数据对新疆野苹果的AP2/ERF家族进行鉴定，结果表明新疆野苹果中涵盖齐全了AP2/ERF基因家族的5个亚家族，且MsERF亚家族数量最多，共有57个，占比为53.77%，MsSoloist亚家族数量最少，仅有2个成员(1.89%)。我们通过进一步的亚家族分类发现MsERF亚家族包含了B1～B6组的全部类型，而MsDREB亚家族缺少A1和A3组，且A2、A4和A5组的成员数量相对于AtDREB亚家族都很少。由于DREB亚家族主要涉及植物抗非生物胁迫，如干旱、高盐胁迫中起主要作用，而ERF亚家族则是在植物抗生物胁迫如抵御病原菌入侵中起主要作用[42]，推测本研究中MsDREB亚家族成员不全且数量较少的现象，可能为使用抗病转录组鉴定AP2/ERF基因家族的局限性导致。此外，与拟南芥相比，AP2、RAV和Soloist 3个亚家族成员数量占比在两个物种间相似，而MsERF亚家族成员数量存在扩张。

AP2/ERF基因家族具有多样的生物学功能，参与了植物诸多生物过程，其中ERF亚家族和DREB亚家族分别在植物生物和非生物胁迫响应过程中起重要作用[8，50-51]。近年来，部分DREB亚家族基因也被报道参与植物病原菌响应功能研究。如在马铃薯中过表达StDREB1能够增加PR2蛋白质、几丁质酶、过氧化酶等相关基因的表达量，从而提高植物对腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)的抗性[52]。而在拟南芥中过表达MsDREB2C则减弱了植株对两种常见病原细菌的抵抗力[53-54]。在本研究中，RNA-seq和qRT-PCR分析发现，新疆野苹果响应腐烂病菌侵染后差异表达基因多集中(约65%)在MsERF亚家族，这与已有文献报道ERF家族在植物免疫防御病原菌过程中起关键作用的观点一致。19个差异表达的MsERF基因分为早、中和晚期3种表达模式，暗示不同的MsERF基因在调控新疆野苹果抵御腐烂病菌过程中可能分工不同。此外，本研究共鉴定到25个MsDREB基因，其中4个MsDREB基因受腐烂病病原菌诱导表达，且都在感染后5 d显著差异表达，推测MsDREB基因可能在新疆野苹果腐烂病响应晚期中发挥作用。另外，前人研究表明Soloist基因能够增强植株对灰霉菌的抗性[55]，而在本研究中共鉴定到2个MsSoloist基因，其中1个MsSoloist(MsSoloist02)在腐烂病菌侵染后1、2和5 d均呈现上调表达趋势，证明MsSoloist在新疆野苹果对腐烂病菌响应的早中晚期均起作用。

TIR结构域(Toll/interleukin-1 receptor domain)是一类存在于动、植物中的受体蛋白质结构域，该结构域在植物病原菌响应中发挥了重要的作用。SARM1(sterile alpha and TIR motif containing 1)蛋白质通过TIR结构域识别病原菌效应蛋白从而启动宿主的免疫反应，也可通过介导NAD+的裂解活性参与宿主的细胞坏死过程，从而参与植物免疫反应[56]。在拟南芥中含有TIR结构域的AtTPR1可通过抑制负向调节因子从而激活R蛋白所介导的免疫反应[57]。但目前关于同时存在AP2和TIR两类保守结构域的转录因子及其功能尚未见报道。本研究中，MsERF亚家族的2个B1组成员(MsERF04和MsERF05)同时含有AP2结构域和TIR结构域。此外，这两个MsERF基因的C-末端还含有EAR motif(ERF-associated amphiphilic repression)。EAR motif一般认为在负调控植物逆境响应中起作用[58-59]。而RNA-seq数据显示，两个具有TIR保守结构域的基因在表达模式上完全不同，MsERF05在4个时间点之间的表达量有明显差异，而MsERF04则几乎没有检测到表达(FPKM值为0)，表明只有MsERF05受腐烂病病原菌诱导表达，而且qRT-PCR数据也证明MsERF05在1 d上调表达69倍。由此推测，TIR和EAR两个结构域在该基因的抗病响应中起到关键作用，下一步将围绕这个特殊的ERF基因(MsERF05)开展抗病功能的研究。

综上所述，基于MsAP2/ERF家族基因的特殊保守结构域和基因表达模式的结果分析，初步靶定MsERF40和MsERF05这两个ERF基因作为重点研究对象，将展开后续基因功能鉴定和调控抗病分子机制研究。通过对新疆野苹果基因资源的挖掘与利用，有助于建立新疆野苹果腐烂病的防治研究的理论基础，为世界栽培苹果抗性分子育种提供优质候选基因。