黄瓜雄性不育突变体C0128的鉴定与不育基因的初步定位

杨志敏，岳宏忠，张海强，李玉红*

(1 西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨陵 712100；2 甘肃农业科学院 蔬菜研究所，兰州 730070)

雄性不育不仅作为重要的农艺性状多用于作物杂交育种和杂种优势利用[1-2]，而且也是研究花药发育的重要材料。拟南芥[3-4]、水稻[5-6]等模式植物关于雄性不育的报道较多且研究相对较深入，已克隆了多个雄性不育基因。葫芦科作物的雄性不育材料较少，且研究多集中于雄性不育突变体表型鉴定、生理生化指标测定、细胞学观察及突变体在育种中的应用方面[7-13]，关于雄性不育基因定位与克隆的报道较少[14-15]。因此，很有必要对葫芦科作物雄性不育材料开展基因挖掘研究，为育种提供可利用的基因资源。

黄瓜(CucumissativusL.)是世界上最重要的蔬菜作物之一[16-17]。中国是全球黄瓜生产面积最大、产量最高的国家。2020年中国黄瓜种植面积达127万hm2，占全球的56.4%(http://www.fao.org/faostat/en/)。据此估算，需要的黄瓜生产用种量达到1.3×103t。人工杂交制种是中国黄瓜种子生产的主要方法[18]，且栽培面积较大的华北型黄瓜很少有雌性系品种[1]，因此，雄性不育材料在黄瓜人工杂交育种生产中的应用会降低成本。对黄瓜雄性不育的研究，早期多集中于表型鉴定如无花瓣ap、多向性花粉败育ms-1、雄花败育ms-2、花朵闭合cl等雄性不育突变体的研究[10-13]，因这些突变体具有不良的农艺学性状，未应用于育种实践。近年来，对黄瓜雄性不育的研究有了新的进展。Zhang等[19]对花粉不育突变体ps进行遗传研究，发现与雄花败育突变体ms-2等位，但并未克隆MS-2雄性不育基因。Han等[14]克隆了黄瓜雄性不育突变体ms-3的候选基因，该基因编码homeodomain (PHD) finger蛋白。Niu等[20]发现了一个与叶型相关的“mango”突变体，该突变体也具有雄性不育的性状，图位克隆了其候选基因CsWOX1，该基因编码WUSCHEL-related homeobox1蛋白。此外，研究发现敲除拟南芥SPOROCYTELESS(AtSPL)的同源基因CsSPL可使黄瓜雄性和雌性育性均降低[21]；沉默拟南芥GLABRA2(AtGL2)同源基因CsGL2-LIKE会降低黄瓜雄性育性、延迟雄花开花[22]；反义抑制营养物质转运相关基因HexoseTransporter1(CsHT1)会使黄瓜雄性育性降低、种子发育异常，下调SucroseTransporter1(CsSUT1)的表达会延迟黄瓜雄花发育、雄性育性降低甚至败育[23-24]。

尽管已有上述研究，但通过正向遗传学的方法仅克隆了ms-3候选基因，挖掘的雄性不育基因严重不足，非常有必要利用新的雄性不育突变体，开展黄瓜雄性不育基因的挖掘研究。本课题组从黄瓜EMS突变体库中筛选到的1个性状稳定遗传的新雄性不育突变体C0128，本研究以该突变体为材料，对其不育特征及遗传规律进行了分析，利用分子标记对突变体的不育基因(暂命名MS-4)进行初步定位，为进一步克隆目标基因、研究该基因功能及在农业生产上的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究以雄性不育突变体C0128及野生型CCMC、育性正常的北美腌渍型黄瓜Gy14为试验材料。以雄性不育突变体C0128作为母本，分别与CCMC和Gy14杂交，构建F1及相应的F2遗传群体进行表型观察、遗传规律分析和基因定位。所有黄瓜材料种植于西北农林科技大学园艺场的塑料大棚里，常规管理。

1.2 试验方法

1.2.1 突变体C0128的雄花表型观察分别随机选5株突变体C0128与野生型植株，取开放前同一时期的雄花花芽和开放当天的雄花，于冰盒中带回实验室，在体式显微镜下观察雄花发育情况。

1.2.2 突变体C0128育性鉴定在盛花期早晨8:00～10:00分别取野生型和突变体各10朵开放雄花于冰盒中，带回实验室进行TTC(质量浓度百分比为2%)染色观察和花粉管体外萌发试验。在载玻片中央滴1滴2%的TTC溶液，轻轻抖动雄蕊，使花粉均匀散在溶液中，盖上盖玻片置湿润滤纸上，在35 ℃恒温培养箱中染色10～15 min。用光学显微镜观察染色情况，每张载玻片取花粉粒均匀的3个视野统计花粉败育情况并进行显著性分析。

在显微镜下观察突变体和野生型的花粉萌发情况，花粉管的体外萌发方法参照王洁[25]，野生型和突变体各取5朵当天开放的雄花，每张载玻片在显微镜下选取花粉粒均匀的3个视野用于数据统计和分析，花粉管长度大于或等于花粉粒直径的花粉粒表明其具有萌发能力[26]。

以野生型CCMC和突变体C0128作为亲本，分别进行自交和正反交，即4种组合：CCMC⊗、C0128⊗、CCMC(♂)×C0128(♀)、C0128(♂)×CCMC(♀)，每个组合在不同植株上选10朵当天开放的雌花授粉。授粉后及时挂吊牌标明所做的杂交组合及杂交时间。授粉24 h后，次日同一时间点每个组合各取5组雌花和子房，放在冰盒中带回实验室。具体试验方法参照Cheng[23]，染色后将组织放到载玻片上在荧光显微镜紫外光(405 nm)下观察花粉管体内萌发情况并拍照分析。余下的5组授粉果，在授粉35 d后采收成熟的果实，剖开并观察果实内部种子的发育情况。

1.2.3 不育性状遗传规律分析分别在田间观察CCMC×C0128的F1、F2和Gy14×C0128的F1、F2共4个群体的单株表型，统计各群体的可育株与不育株的性状分离比，用卡方测验分析雄性不育性状的遗传规律。

1.2.4 目的基因的初步定位采用CTAB法分别提取两亲本C0128和Gy14的DNA，利用实验室已有的、均匀分布在黄瓜7条染色体上的SSR引物和InDel引物，以两亲本的DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，观察分析电泳条带结果，从而筛选出在两亲本间具有多态性的引物。采用混合分组分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)，在作图群体中分别随机选取7株雄性可育株和不育株，提取基因组DNA(质量浓度均控制在50 ng/μL)，等量分别混匀构建雄性可育池和雄性不育池。

利用在两亲本间筛选出的多态性引物，分别以两池的DNA为模板，进行PCR扩增和PAGE电泳，在两池间进一步筛选具有多态性的标记，确定雄性不育基因MS-4所在染色体。利用两池间具有多态性的引物在Gy14×C0128 F2的64株作图小群体中，以每个单株的DNA为模板进行PCR扩增和PAGE电泳，电泳带型与突变体C0128带型一致的记为A，与野生型Gy14带型一致的记为B，与F1带型一致的记为H。观察分析小群体植株表型和电泳带型结果，筛选交换单株，进行MS-4初步定位。然后在此基础上，继续扩大定位群体和开发新的标记，逐步缩小MS-4定位区间。

PCR反应和PAGE电泳分析参考Weng等[27]，连锁分析参见Rong等[28]。

2 结果与分析

2.1 突变体C0128的雄花表型观察

突变体除雄花发育存在差异外，在其他主要农艺性状如株高、茎粗等方面与野生型植株无差异。突变体的雄花具有正常形态的花萼(图1，A-B)，花瓣和花药小于野生型，花药颜色与野生型一样呈现金黄色，但花药上无明显的花粉粒(图1，C-D)。

2.2 突变体C0128花粉育性分析

花粉粒的TTC染色和花粉体外萌发试验结果表明，野生型的花粉粒大多数可以被染成红色(图2，B)，且多数花粉粒经过25 ℃孵育2 h后花粉管明显伸长(图2，D)，花粉活力和萌发率均在80%以上(图2，E-F)；而突变体雄花在视野下无花粉及花粉粒萌发(图2，A、C)，说明突变体的雄性不育是由于花粉粒的缺失造成的。

利用苯胺蓝染色法对花粉在体内萌发情况进行研究，结果发现野生型CCMC作为父本的组合，柱头上附着的花粉粒(图3，A、C)及在子房中已萌发伸长的花粉管(图3，B、D)均可以被苯胺蓝染色，而突变体C0128作为父本的组合检测不到柱头上的花粉粒(图3，E、G)及子房中萌发的花粉管(图3，F、H)，再次验证了突变体C0128是花粉缺失型突变体。

对上述4种组合的果实进行留种观察，结果发现野生型CCMC作为父本的组合均可以获得正常发育且饱满的种子(图4，A-B)，而突变体C0128作为父本的组合内部全为瘪种子，剥开种皮发现没有胚和胚乳(图4，C-D)。该结果表明突变体作为父本子代不育，但作为母本子代可育，说明突变体C0128雄性不育，但雌性可育。

2.3 突变体雄性不育表型的遗传规律分析

CCMC×C0128和Gy14×C0128的F1代植株雄花和雌花发育均表现正常。在CCMC×C0128的146株F2群体中，可育株∶不育株为103∶43，分离比约为3∶1(P=0.214 1)；在Gy14×C0128的1 231株F2群体中，可育株∶不育株为908∶323，分离比也约为3∶1(P=0.315 5)。经卡方测验符合孟德尔遗传定律，表明突变体C0128的雄性不育性状可能由1对隐性核基因调控。

2.4 突变体雄性不育基因MS-4定位

利用实验室已合成的均匀分布在黄瓜7条染色体上的SSR引物和InDel引物，在两亲本之间筛选出110对具有多态性的引物，进一步在雄性可育池/不育池之间筛选，共筛选出8对在两池间具有多态性的引物(表1)，且这8对多态性SSR引物都位于黄瓜第3染色体上。

表1 突变体C0128雄性不育基因MS-4定位所用标记Table 1 Markers for MS-4 mapping of mutant C0128 male sterile gene

利用这8对多态性引物在64株的作图小群体中进行MS-4的初步定位，构建初定位遗传图谱(图5，A)，将MS-4定位在Chr3的Li162和Li172两个标记之间的5.1 Mb区间内。在该定位区间开发sf06、sf14、sf46和sf43共4对与MS-4紧密连锁的SSR分子标记，并扩大定位群体至1 231株，最终将MS-4定位在sf14和sf46两个标记之间1.21 Mb区间内(图5，B)。

通过葫芦科基因组网站对MS-4定位的1.21 Mb区间基因进行分析，发现该区间内共有149个基因，主要编码转录因子(如MYB、bHLH等转录因子)、各种酶类(如激酶、转移酶、合成代谢酶)和蛋白质等。149个基因中有8个基因可能会影响黄瓜雄性育性，分别是CsaV3_3G015960、CsaV3_3G016780、CsaV3_3G016880、CsaV3_3G017010、CsaV3_3G017120、CsaV3_3G017190、CsaV3_3G017210、CsaV3_3G017220，分别编码转录因子RF2a(Transcription factor RF2a)、双组分响应调节器ARR14-like(Two-component response regulator ARR14-like)、雄蕊特异蛋白FIL1-like(Stamen-specific protein FIL1-like)、皮瓣核酸内切酶GEN-Like(Flap endonuclease GEN-like)、假定的肌动蛋白解聚因子(Actin depolymerizing factor, putative)、细胞色素P450(Cytochrome P450)、信号肽类肽酶3(Signal peptide peptidase-like 3)、裂解和多聚腺苷酸化特异性因子亚基2(Cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 2)。

3 讨 论

黄瓜上目前已鉴定的雄性不育突变体主要有6个：1)无花瓣败育ap，该突变体花冠缺失，花药向花萼方向生长转化；2)多向性花粉败育ms-1，其雄花不能开放、花粉不育率为30%～90%，且雌花育性降低；3)雄花败育ms-2，极少数的雄花开放，但花药发育异常，不能产生花粉；4)花朵闭合cl，雌雄花都不能开放；5)花粉败育ps，雌雄花的花冠正常，雌花可育，雄蕊花药退化、无花粉；6)雄性不育ms-3，雌雄花都有正常的花冠，雌花的育性正常，但雄花花药淡绿色、花粉缺失[10-14,19]。此外，还有Niu等[20]发现的叶子皱缩不平展、花瓣变窄、果实形似芒果的“mango”突变体也具有雄性不育的特征。而在本研究中突变体C0128花瓣变小但形状正常，花药变小、颜色正常，雌花正常可育。这些形态特征表明突变体C0128与之前已报道的黄瓜雄性不育突变体不同，是一个新的黄瓜雄性不育突变体材料。

在拟南芥、水稻等模式植物上已克隆了多个雄性不育基因，涉及几个转录因子和酶类。转录因子主要通过调控花药发育途径从而影响雄性育性，如MYB类转录因子MYB103/188、bHLH类转录因子DYT1、AMS等等[29]；酶类主要通过合成、转化或降解等过程为花药发育提供所需要的物质，如GDSL[30]、KCS[31]、ACOS5[32]等，还有一些激酶HXK5[33]和转移酶GPAT6[34]等也参与花药发育。在葫芦科作物中克隆的雄性不育基因较少，西瓜上仅克隆了2个雄性不育基因Cla006625和Cla010576，分别编码Pollen-specific leucine-rich repeat蛋白[35]和与拟南芥的bHLH091、bHLH089、bHLH010同源的bHLH转录因子[36]。甜瓜上仅克隆了雄性不育突变体ms-5的候选基因CmAMS，其编码bHLH家族的MYC类转录因子[37]。黄瓜上，Han等[14]图位克隆了雄性不育基因MS-3的候选基因，其编码homeodomain(PHD) finger蛋白；Niu等[20]图位克隆了 “mango”突变体的目的基因Csa1M042780，编码WUSCHEL-related homeobox1蛋白，该基因突变不仅影响叶形、果形、花形，还抑制花药及花粉发育，导致花粉异常。上述已克隆的葫芦科作物雄性不育基因均不在MS-4定位区间内。

本研究MS-4定位区间内的149个候选基因中，有8个候选基因的同源基因在其他植物上已被报道会影响植物雄性育性。CsaV3_3G015960的同源基因DRINKME(DKM)，在拟南芥过表达植株中，花药变小、花粉量减少，降低了雄性育性[38]；CsaV3_3G016780的同源基因编码Response Regulator2(ARR2)是花粉特异性转录因子，通过调控拟南芥花粉发育途径影响花粉发育[39]；CsaV3_3G016880的同源基因编码A9启动子，是拟南芥最早发现的一个绒毡层特异性启动子，通过与转录因子结合调控雄性生殖器官发育影响育性[40]；CsaV3_3G017010的同源基因OsGEN-Like，在水稻中沉默后大部分植株会降低雄性育性甚至败育，其败育是由于早期小孢子发育缺陷而不能产生成熟花粉[41]；CsaV3_3G017120同源基因编码的Actin-Depolymerizing Factor 10(ADF10)在拟南芥中主要通过影响花粉管的生长从而影响雄性育性[42]；CsaV3_3G017190的同源基因CYP715A1是Cytochromes P450家族成员，在拟南芥花蕾的绒毡层和开花的花药中特异性表达[43]，可能与雄性育性相关；CsaV3_3G017210在拟南芥中的同源基因编码Signal Peptide Peptidases(AtSPP)，AtSPP是拟南芥雄配子体发育和花粉成熟所必需的因子[44]；CsaV3_3G017220的同源基因编码Defective in snRNA Processing 1/4复合体(DSP1/4)，DSP1/4突变后都会影响拟南芥雄配子体的发育，且双突变体表现为雄性不育[45-46]；在本研究中突变体C0128不能产生花粉粒，除推测CsaV3_3G015960和CsaV3_3G017120可能不是MS-4候选基因外，其余6个候选基因均有可能是MS-4的候选基因，需进一步扩大定位群体对MS-4进行精细定位和克隆才能初步确认MS-4的候选基因。

作者贡献：杨志敏完成了本研究的主要内容及手稿撰写；岳宏忠参与试验设计，提供试验指导，引物设计与合成；张海强负责构建杂交群体；李玉红教授设计本研究、试验指导及论文修改。所有作者都对文章作出了贡献，并批准提交。