乙烯合成酶基因CitACS4突变导致 西瓜雄花完全花同株性型

纪高洁 张洁 张海英 孙宏贺 宫国义 史建廷 田守蔚 郭绍贵 任毅 沈火林 高俊平 许勇

目的与意义：乙烯在葫芦科作物性别决定过程中起着至关重要的作用，乙烯合成酶基因ACS突变导致黄瓜和甜瓜雄花完全花同株性型产生，然而在西瓜雄花完全花同株性型产生过程中该基因是否具有同样作用仍不清楚。通过对心皮原基特异表达的西瓜乙烯合成酶基因CitACS4进行基因功能验证，以期明确西瓜雄花完全花同株性型产生的原因，为西瓜的基因改良提供理论基础。

材料与方法：利用生物信息学方法鉴定出西瓜的ACS基因。使用聚合酶链式反应（PCR）从具有不同性型的25个西瓜种质库（包含19种雌雄同体，1种雌性系，5种雄花完全花同株）中扩增CitACS4的基因组序列，进行序列比对鉴定与雄花完全花同株性型共分离的SNP，利用该SNP位点开发dCAPs标记。以雄花完全花同株系AKKZW（aa）和雌雄同株系XHB（AA）杂交构建F2群体。进一步利用酶活性检测、组织特异性表达分析验证CitACS4基因在雄花完全花同株性型产生过程中的作用。

结果与分析： （1）同源性和结构分析：在西瓜基因组鉴定得到8个ACS基因，其中CitACS4与甜瓜的CmACS-7基因在氨基酸水平上具有94%的序列一致性。CitACS4基因组全长1 720 bp，包含3个外显子和2个内含子，编码具有444个氨基酸的多肽。（2）多态性位点分析：从具有不同性型的25个西瓜種质库（包含19种雌雄同体，1种雌性系，5种雄花完全花同株）中扩增了CitACS4的基因组序列。鉴定出G1477C的SNP与雄花完全花同株性型共分离，该突变在残基364处引起半胱氨酸（C）至色氨酸（W）的替换（命名为C364W）。（3）C364W替换与雄花完全花同株性型的相关性：以雄花完全花同株系AKKZW（aa）和雌雄同株系XHB（AA）之间的杂交构建了F2群体，用于检测C364W替换是否与雄花完全花同株性型相关。设计dCAPs标记dCAPs_FspBI以检测G1477C的多态性。440个F2子代群体的基因型分析显示，获得的107株雄花完全花同株性型植物与dCAPs_FspBI的aa基因型共分离，而剩余的333个后代中没有表现为雄花完全花同株性型，表明a基因与C364W替换密切相关。（4）C364W突变对ACS酶活性的影响：ACS蛋白具有12个保守框，C364W位于保守框6中。ACS酶活检测分析表明C364W突变降低了CitACS4的酶活性（原图2-A）。CitACS4的三维建模表明C364残基位于α-羧酸骨架中。在该模型中，半胱氨酸残基具有巯基，其可能潜在地形成二硫键以维持蛋白质稳定性。C364W替换可能破坏了CitACS4的稳定性，随后破坏了酶的活性。（5）CitACS4基因的表达分析：组织特异性表达分析发现CitACS4在雌花和完全花中特异性表达（原图2-B）。RNA原位杂交分析显示，在stage5和stage6，CitACS4在雌性和完全花花蕾的心皮原基中特异性表达（原图2-C～D），而在雄性花蕾中未检测到表达（原图2-E）。CitACS4表达模式与黄瓜CsACS2和甜瓜CmACS-7基因相类似。

结    论： 西瓜中的雄花完全花同株性型是由CitACS4中的隐性突变引起的。CitACS4编码的乙烯合成酶在雄花完全花同株性型西瓜中的活性受损，这可能使心皮原基中乙烯产生减少进而导致雄花完全花同株性型产生，该结果将来可应用于西瓜育种和遗传改良。