免疫印迹法与间接免疫荧光法在副肿瘤性天疱疮自身抗体检测中的应用)

张 燕 彭明霞 潘 萌

副肿瘤性天疱疮(paraneoplastic pemphigus，PNP)是1990年被命名的一种罕见的累及皮肤黏膜的自身免疫性大疱性疾病，常伴发肿瘤，多为淋巴增生性肿瘤，可累及多个内脏器官。患者体内存在多种自身抗体成分，可与多个器官或组织的上皮成分结合，如膀胱、呼吸道、小肠及大肠、甲状腺、心肌及骨骼肌等[1]。PNP病情危重，死亡率高，因此，早期诊断、早期治疗对提高患者的生存率尤为重要。目前，除了临床表现和组织病理学检查外，间接免疫荧光(indirect immunofluorescence，IIF)也是主要的临床检测手段，但一般用于自身免疫性大疱性皮肤病的IIF底物为猴食道上皮，由于其主要成分为复层鳞状上皮，而非移行上皮，故检出率较低。为进一步提高检出率，探索PNP的早期诊断手段，本研究采用以鼠膀胱和猴食道为底物的IIF和以人表皮提取物为抗原的免疫印迹(immunoblot，IB)检测，对其在临床诊断中的应用进行研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2007年7月—2017年10月上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科病房收治的11例PNP患者资料，其中男4例、女7例；年龄范围13～53岁，平均年龄为32岁；病程2～36个月，平均病程为9个月。所有患者均符合PNP的临床和病理学诊断。所有患者均检出肿瘤，其中7例伴有卡斯尔曼(Castleman)瘤(2例卡斯尔曼瘤伴滤泡树突细胞增生)，2例伴有胸腺瘤，1例伴有纤维组织淋巴瘤，1例伴有起源于卡斯尔曼病的淋巴结滤泡树突肉瘤。对照组选取同期本院健康体检者4例，年龄、性别与PNP组相当。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG抗体(美国ThermoFisher Scientific公司)；BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；高分子量预染蛋白Marker(10带，加拿大Fermentas公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体(碧云天生物技术有限公司)；硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜购自美国ThermoFisher Scientific公司。

1.2.2 主要仪器 荧光显微镜(德国Leica公司，型号为DM2500)；聚丙烯酰胺凝胶电泳系统(美国Bio-Rad，型号为165-8001、164-5050、170-3930)。

1.3 方法

1.3.1 血清样本 收集11例PNP患者共15份血清(其中4例为术前和术后各2份血清)，其中6份为手术前患者的血清样本，9份为手术切除肿瘤后1～6个月的患者血清样本。对照组为4例正常人血清样本。

1.3.2 IIF 分别以猴食道和鼠膀胱为底物，检测患者血清中的PNP抗体，阳性者见表皮细胞间免疫球蛋白G(IgG)呈网状沉积，显示绿色荧光。

1.3.3 IB 取健康成人新鲜环切包皮，去除皮下组织，浸入表皮分离液中，4 ℃静置48 h后剥离表皮，转入500 μL RIPA蛋白裂解液，裂解30 min后，离心，收集上清液，用BCA法测定蛋白质含量，作为人表皮细胞蛋白提取液。参照文献[2]的方法，将上述得到的蛋白质通过SDS-PAGE将人表皮细胞蛋白抗原按分子质量大小分离，湿式转膜将蛋白转印至NC膜上，以β-actin作内参照。以患者及对照组血清为一抗，以HRP标记的羊抗人IgG抗体为二抗，用增强化学发光法(ECL)检测转印膜上目的条带的表达。

1.4 统计学处理 应用SAS 9.2 统计学软件。计数资料以频数(n)表示，数据比较采用Fisher确切概率法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IIF检测结果 11例PNP患者血清中，在鼠膀胱黏膜上皮细胞间有IgG型自身抗体表达且呈网状沉积者6例，阳性血清中PNP抗体的滴度为1∶50～1∶100。见图1。对照组血清未见在鼠膀胱黏膜上皮细胞间呈阳性表达。以猴食道为底物行IIF检测，结果均呈阴性。

A IgG型自身抗体呈网状沉积 B 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色图1 以鼠膀胱上皮为底物的IIF检测荧光显微镜下阳性表现示意图(×100)

2.2 IB检测结果 11例PNP患者中，有7例患者的血清中检测到特异性IgG型自身抗体，位于190 000 Da处，其中5例呈现出双条带，同时在210 000 Da处呈现阳性条带。4例患者检测了术前、术后2份血清，术前血清均在190 000 Da处呈现阳性条带，其中2例患者的术后血清转为阴性。对照组血清未呈现任何特异性条带。见图2。其他4例患者血清为阴性，其中3例患者血清采样时已使用药物治疗3个月以上，且肿瘤已经手术切除。

2.3 IIF和IB在PNP抗体检测中的比较 11例PNP患者中，IIF检出阳性6例，IB检出阳性7例，差异无统计学意义(P=0.31)。其中两种检测方法结果均呈阳性者5例；IB阳性，IF阴性者2例；IIF法阳性，IB阴性者1例。其他3例血清两种方法检测均为阴性。

3 讨 论

PNP是一种严重危及生命的自身免疫性大疱性皮肤黏膜疾病，其免疫学特点为患者血清中存在Plakin家族的多克隆IgG抗体。针对的Plakin蛋白的抗原包括包斑蛋白EP(envoplakin，210 000)、周斑蛋白PP(periplakin，190 000)、桥斑蛋白(desmoplakin，DP)Ⅰ和Ⅱ(相对分子质量分别为250 000、210 000)，其中最具特征性和一致性的为EP和PP，可作为PNP确诊依据。近年来发现，PNP患者血清中存在抗-α2巨球蛋白样1蛋白(alpha-2-macroglobulin-like-1，A2ML1)抗体。A2ML1是一种蛋白酶抑制剂，在表皮、甲状腺及睾丸中均有表达。Numata等[3]发现，抗A2ML1抗体与PNP的早期发生有关，这为PNP早期筛查提供了思路。

本研究以正常人表皮提取物进行IB分析，7例PNP患者血清检测到与表皮分离抗原结合的IgG抗体，均与相对分子质量为190 000的表皮抗原发生反应，其中5例患者血清同时与相对分子质量为210 000的表皮抗原发生反应。与既往研究[3]结果不同，本研究未检测到相对分子质量为250 000的DPⅠ和170 000的A2ML1条带。究其原因，可能是IB检测过程中SDS-PAGE电泳使大分子降解，在结构上破坏了敏感的抗原表位；也可能与表皮抗原提取过程及检测抗体技术操作流程不同有关。最新研究[4]结果表明，当前推荐的PNP血清学诊断技术检测抗A2ML1抗体的灵敏度和特异度欠佳。利用基于绿色荧光蛋白的新型活性真核A2ML1 ELISA试剂盒进行检测，其灵敏度和特异度均较高[4]。另外，本试验分离正常表皮并提取抗原，进行IB反应，结果中阳性率较低，可能与患者经过治疗后自身抗体的滴度下降有关。

抽取PNP患者血清以鼠膀胱或人皮肤为底物进行IIF检测可见上皮细胞间荧光表达，提示患者血清中存在着可识别复层鳞状上皮和移行上皮的循环抗体，此法诊断PNP具有较高的特异度和灵敏度[5]。本研究以鼠膀胱为底物，对11例患者血清进行检测，阳性率为 54.55%。而以猴食道上皮为底物时均未呈现阳性结果。这可能与PNP患者血清中的循环抗体与膀胱上皮结合的能力最强有关，因为膀胱是移行上皮，内含大量桥粒或细胞内物质的成分[1]。本研究证明了鼠膀胱移行上皮是检测PNP自身抗体的敏感底物，可作为PNP的过筛试验。

总之，IB检测PNP患者血清可识别角质形成细胞提取物中的EP(210 000)和PP(190 000)，从而确诊PNP，但方法复杂。而以IIF检测PNP患者血清，方法简便易行，且灵敏度和特异度均较高，但因不同底物导致不同的结果，建议以鼠膀胱移行上皮为底物。所以，对那些有典型PNP临床及病理学表现而尚未确诊的自身免疫性大疱性皮肤病患者应以鼠膀胱为底物行IIF检测作为过筛试验，以及时发现潜在肿瘤。在条件允许的情况下行IB试验以确诊。