骨炎膏对大鼠感染性创面TNF-α和IL-6表达的影响

陈 勤,马文龙,陈 柯,谢 艳,曹向阳,田可为,范克杰,王庆丰

(1.河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南 洛阳 471000；2. 湖南中医药大学，湖南 长沙 410000)

严重创伤造成的急性皮肤软组织缺损创面十分常见，此类创面常伴有细菌感染，金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌[1]。对于感染创面，西医除进行伤口局部换药及全身使用抗生素治疗外，尚有多种治疗方法，如VSD技术、臭氧、富血小板血浆、超声清创技术、原位再生医疗技术等，以上治疗方式虽在临床应用并取得一定疗效，但也部分存在疗效欠佳、费用较高、手术创伤等不足。与西医治疗方法相比，中医治疗具有治疗方法多样、费用低廉、无手术创伤、患者痛苦小等优势，其中膏、散外敷因其疗效确切、安全性高、药物易于存储、药效持久、操作简便等优势在临床运用广泛[2-3]。如生肌玉红膏[4]、京万红软膏、回阳生肌膏[5]等均具有去腐生肌、消肿止痛、活血解毒等功效，有促进创面愈合的作用。骨炎膏是河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)内部外用制剂，可明显促进感染性创面愈合。本研究拟通过观察骨炎膏对大鼠感染性创面组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)表达的影响，探讨其促进感染性创面愈合的部分作用机制，以为临床应用提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 生长状况良好的SPF级成年健康SD大鼠72只，体重(210±10)g，购于河南省实验动物中心，合格证编号：SCXK(豫)2017-0001。全部于河南省洛阳正骨医院动物实验室普通饲料喂养，饮用水为纯净自来水，饲养实验室温度及湿度适中，环境清洁，适应性喂养3 d后，将所有健康大鼠纳入实验。

1.2实验用菌株及药物 标准金黄色葡萄球菌、10%水合氯醛均由河南省洛阳正骨医院实验动物中心提供。骨炎膏(糊剂)由河南省洛阳正骨医院内部制剂科提供，豫药制字Z20120264，主要成分：黄芪、土茯苓、当归、商陆、白芷、黄芩、连翘、紫草、红花、大黄、虎杖、甘遂、大戟、龙骨。京万红软膏(北京同仁堂生产，国药准字 212020440，主要成分为地榆、桃仁、紫草、当归、五倍子、地黄、黄连、冰片)。

1.3主要仪器 ELISA试剂盒(上海纪宁实业有限公司，批号：201510)、实验大鼠剃毛器(上海泽雅科教仪器有限公司 )、实验动物称重器(上海玉研科学仪器有限公司)、电热恒温水槽(上海一恒科技仪器有限公司)、石蜡包埋机(湖北泰维科技实业有限公司)、恒温摊片烤片机(湖北泰维科技实业有限公司)、TC-120S 型组织脱水机(湖北泰维科技实业有限公司)、压力蒸汽灭菌器(SANYO MLS-3780)、RD-201V型冷冻离心机(四川蜀科仪器有限公司)、LKB-NOVA型超薄切片机(以色列NOVA检测设备公司)、Nikon-PFX型光学显微镜(日本尼康公司)、L-160DTP型万分之一分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、Image图像分析系统软件(DMCII-Pro Plus6.0)。

1.4实验方法 随机抽取18只大鼠作为正常创面组，剩余54只大鼠制作成金黄色葡萄球菌创面感染模型。正常创面制备方法：造模前禁食、禁水6 h,采用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉后，将大鼠左侧卧位固定，充分暴露脊柱右侧皮肤，用红色记号笔描记脊柱右侧3 cm×3 cm大小正方形的皮肤范围，使用宠物剃毛器完全剔除大鼠背部描记范围内的体毛，用碘伏消毒手术部位，沿记号笔标记的范围进行全层皮肤切除并破坏皮下浅筋膜直至肌层，创面充分止血后覆盖无菌纱布包扎固定。感染创面制备方法：前期操作同正常创面制备方法，于创面充分止血后创面处接种含量为1×109CFU/mL金黄色葡萄球菌液1 mL，纱布包裹后使用医用胶布粘贴牢固，第2天见创面附有脓性分泌物、渗液较多、创缘皮色发红即为急性感染性创面造模成功。将感染性创面造模成功大鼠随机分为感染创面组、骨炎膏组、京万红组，每组18只，分笼饲养。造模成功后第1天开始，助手配合固定大鼠，用剪刀剪开原有覆盖胶布后轻柔揭开伤口覆盖纱布，正常创面组及感染创面组大鼠创面予生理盐水棉球擦拭后，直接用无菌纱布及医用胶带包扎固定；京万红软膏组取适量京万红软膏(约2 g)均匀涂抹于大鼠创面上，厚度适中，以完全覆盖创面为宜，后予无菌纱布包裹后使用医用胶布粘贴牢固；骨炎膏组将涂抹骨炎膏的无菌纱布(将骨炎膏搅拌均匀，取约5 g涂抹于无菌纱布上，厚度适中)覆盖创面后，使用医用胶布粘贴牢固。各组均每天换药1次，直至创面完全愈合。

1.5检测指标及方法

1.5.1创面愈合率 分别测算并记录各组大鼠造模后第3天、第7天、第14天创面愈合面积。用数码相机对创面拍照，比对标尺，采用计算机DMCII-image-Pro Plus6.0图像分析系统软件分析创面面积并进行计算。第n天创面愈合率(%)=(原始创面面积-第n天创面面积)/原始创面面积×100%[6]。造模时大鼠创面面积即为原始创面面积。

1.5.2创面愈合时间 以肉眼观察到的大鼠创面完全上皮化所需的时间为创面愈合时间。愈合标准：创面平齐，表皮爬行，创面未愈合距离<1 mm且大鼠生命体征良好。

1.5.3创面组织中TNF-α、IL-6含量 分别于造模后第3天及第7天每组随机取6只大鼠、第14天取剩余大鼠，采用水合氯醛腹腔注射麻醉后处死，取创面边缘至中心的创面组织约2 g，使用ELISA法检测TNF-α、IL-6含量。

2 结 果

2.1实验大鼠情况 实验过程中，感染组及骨炎膏组各死亡1只，考虑为创面较大、无法耐受感染导致。

2.2创面愈合率比较 造模后第3天、第7天、第14天，感染创面组、骨炎膏组、京万红组创面愈合率均明显低于正常创面组(P均<0.05)；感染创面组、骨炎膏组、京万红组造模后第3天创面愈合率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；骨炎膏组和京万红组造模后第7天、第14天创面愈合率均明显高于感染创面组(P均<0.05)，且骨炎膏组均明显高于京万红组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常创面组和感染创面各组大鼠各时间点创面愈合率比较

2.3创面愈合时间比较 感染创面组、骨炎膏组、京万红组、正常创面组创面愈合时间分别为(22.4±0.9)d、(18.3±1.1)d、(20.5±0.6)d、(15.6±0.9)d，正常创面组创面愈合时间均明显短于其他组(P均<0.05)，骨炎膏组和京万红组大鼠创面时间均明显短于感染创面组(P均<0.05)，且骨炎膏组明显短于京万红组(P<0.05)。

2.4各时间点创面组织中TNF-α、IL-6含量比较 造模后第3天、第7天、第14天，各组大鼠创面组织中TNF-α、IL-6含量均呈逐步下降趋势，但感染创面组、骨炎膏组及京万红组大鼠创面组织中TNF-α、IL-6含量均明显高于正常创面组(P均<0.05)；造模后第3天，骨炎膏组及京万红组大鼠创面组织中TNF-α含量均明显低于感染创面组(P均<0.05)，IL-6含量与感染创面组比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模后第7天、第14天，骨炎膏组及京万红组大鼠创面组织中TNF-α、IL-6含量均明显低于感染创面组(P均<0.05)，且骨炎膏组均明显低于京万红组(P均<0.05)。见表2。

表2 正常创面组和感染创面各组大鼠各时间点创面组织中TNF-α、IL-6含量比较

3 讨 论

细菌、创伤或机体自身的错误免疫反应发生都会触发炎症反应。炎症反应是通过清除异物以改善伤口环境从而加速愈合的过程，其发生是由于炎性趋化因子激活，受到损伤的细胞通过结合选择性受体后释放趋化因子，激活巨噬细胞和嗜中性粒细胞释放炎性细胞因子如IL-6和TNF-α，这些炎性因子通过与它们各自的受体相互作用而致[7-8]。IL-6细胞因子家族包括IL-6、IL-11、IL-27、IL-31、制抑素M、白血病抑制因子、睫状神经营养因子、心肌营养因子1和心肌营养因子样细胞因子1，它们在细胞增殖、存活、迁移、侵袭和炎症过程中起关键作用[9]。IL-6主要由淋巴细胞、骨髓细胞、成纤维细胞和上皮细胞产生，其是一种多功能的NF-κB调节细胞因子，可以作用于上皮细胞和免疫细胞。内毒素和白细胞介素-1β(IL-1β)可刺激淋巴样细胞产生IL-6，IFN-γ可以协同IL-1β增加IL-6产生，TGF-β和环磷酸腺苷(cAMP)可以促进IL-6分泌。IL-6作为关键的促炎因子，在多项炎症相关的研究中被作为观察指标，如肠道伤口愈合等[10-11]。TNF-α主要由活化的巨噬细胞和T淋巴细胞合成，其他细胞如肥大细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、肠上皮细胞、平滑肌和心肌细胞、成纤维细胞、破骨细胞也可产生TNF-α[12]。身体健康的情况下，TNF-α几乎检测不到，但在炎症和感染条件下，机体血清和组织中TNF-α表达皆会升高，其升高的水平与感染的严重程度相关[11]。 因此，TNF-α是炎症的关键调节因子，其相关的疾病包括感染性创面牛皮癣、类风湿关节炎和溃疡性结肠炎[13]。故本研究选取了具有代表性的炎症因子IL-6和TNF-α来作为炎症指标进行观测。

感染性创面在中医属“疮疡”范畴，多由外伤兼染毒而成，典型表现为局部红肿热痛及溃后流脓，属于典型的阳证疮疡[14]。根据中医学观点,阳证疮疡一般由火毒、热毒引起,内郁热毒以及外感邪毒使经络阻塞、气血不畅,气血不能养肤则腐肉渐生，疮疡迁延日久还可导致全身经脉受损，究其根源实为正气虚损，邪气入侵。中医“整体观念”认为，对感染性创面的治疗并不应只局限于局部的损伤，还应当着眼于全身的整体治疗，正如《外科理例》中所言“生肌之法，当先理脾胃，助气血为主，则肌肉自生”。对于疮疡的分期，古代医家多采用正邪盛衰的辨证方法来判断。疮疡初期，正气尚强，正能胜邪，则疮疡限于局部无法蔓延，或疮疡渐为消散无法发展。若正邪相争，则肿势渐盛，热毒与腐肉相互影响而成脓毒积于其中，为成脓期，此时应消肿排脓，或直接切开引流，或使用散瘀排脓之类药物治疗。疮疡迁延不愈至后期，为溃疡期，若正气尚可，则溃疡脱落而新肉始生；若正气衰微无力鼓动祛除腐肉生肌而愈，则疮疡日久无法痊愈，最终变为全身消耗性疾病，此时，正虚为本，邪胜为标，应主要使用扶正治法，兼以活血化瘀、祛腐解毒[14]。

骨炎膏方以黄芪、土茯苓为君，当归、商陆、白芷、黄芩、连翘、紫草、红花、大黄、虎杖为臣，甘遂、大戟、龙骨为佐。全方具有清热解毒、祛瘀拔毒、生肌收口、滋润肌肤之功效，不但可改善局部微循环，缓解创面疼痛，减轻肿胀，还可保持湿性环境和促进感染性创面愈合，且其临床操作简便。陈红干等[15]将骨炎膏方应用于全髋关节置换、股骨干骨折内固定及胫腓骨骨折内固定等清洁伤口术后早期感染的治疗，结果显示伤口均一期愈合，且无后遗症。王新江等[16]将骨炎膏用于治疗手指感染患者,治疗有效率为87.5%。

本实验研究结果显示，在感染性创面愈合的中期及后期，骨炎膏及京万红软膏均能促进创面加速愈合，骨炎膏促愈作用优于京万红软膏。炎症因子的观察显示，在创面愈合过程中，与正常创面比较，感染创面中 TNF-α、IL-6含量均更高；骨炎膏组及京万红组干预后第7天及第14天，创面组织中TNF-α、IL-6含量均明显低于感染创面组，且骨炎膏组TNF-α、IL-6含量明显低于京万红组。提示促炎因子高表达是感染性创面愈合迟缓的原因之一，骨炎膏外敷可能通过下调炎症介质的表达，改善炎症环境及控制炎症反应，进而促进感染创面愈合。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。