温肺降浊方联合ROCK2-shRNA转染对血管性痴呆大鼠的神经保护作用

向军军，莫雪妮，杨璧璘，李晓琼，林荣清，黎军宏，胡跃强

(1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2. 广西中医药大学，广西 南宁 530200)

血管性痴呆的发病率较高，其发病机制尚不完全清楚[1]。笔者团队认为，肺脏虚损及功能失调在血管性痴呆发病中起着重要作用，前期研究证实在此理论基础上制定的温肺降浊方可显著改善血管性痴呆患者及大鼠的认知障碍[2-3]，但其作用机制还有待于进一步阐明。目前认为学习记忆功能与突触可塑性密切相关，而神经再生是重建突触联系的结构基础[4]。Ras同源基因家族成员A(ras homolog gene family member A,RhoA)是Rho家族的重要成员，其与Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶2(rho-associated coiled coil-forming protein kinase,ROCK2)形成的RhoA/ROCK2信号通路对神经元生长有调控作用，阻断该通路可促进神经生长和轴突再生[5]，是当前研究的热点。本实验基于ROCK2-shRNA转染技术，探讨了温肺降浊方是否通过抑制ROCK2生成达到促进海马神经元再生的目的。

1 实验材料和方法

1.1实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠60只，3月龄，体重(250±50)g，由湖南斯莱克景达物实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0004。大鼠自由饮食、饮水，室温、60%湿度的受控环境中，适应性喂养1周。实验流程及动物处理遵循动物实验管理条例；本研究经广西中医大学伦理委员会批准(伦理 DW20211204-196)。

1.2实验药物 温肺降浊方由制附子20g、党参15 g、干姜10 g、酒大黄10 g、田七10 g、炙甘草10 g组成，配方颗粒由广西中医药大学第一附属医院药剂科统一采购备用(每单味药要求同一产地、同一质量层次、同一批次，由江苏江阴天江药业有限公司提供)，大鼠给药浓度及等效剂量按体表面积换算。AAV9-ROCK2-shRNA注射液及空载体腺相关病毒由上海吉满生物科技有限公司制造。

1.3主要试剂和仪器 Tunel检测试剂盒(北京中杉，批号: 11260228)；Morris水迷宫视频分析系统(上海软隆科技发展有限公司，型号BW-MMM101)；MICROM HM355S 型全自动石蜡切片机(德国美康公司)；JEM-1200EX型透射电子显微镜(美国FEI公司)；大鼠脑立体定位仪(日本成茂公司) 。

1.4分组、模型制备及干预方法 按随机数字表将大鼠随机分成假手术组、模型组、中药组、ROCK2干扰组、阴性对照组、中药+ROCK2干扰组，每组10只。除假手术组外，其余组均参照文献[7]方法，采用双侧颈总动脉永久性结扎法制备血管性痴呆模型。评估模型成功后，ROCK2干扰组及中药+ROCK2干扰组立即注射稀释至5.07E+12VG/mL的AAV9-ROCK2-shRNA，每只动物注射总量4 μL，持续5 min。注射坐标(以前囟为0点)-皮质(前)：向前1.0 mm，右侧旁开2.0 mm，深度1.2 mm；皮质(后)向后3.0 mm，右侧旁开1.5 mm，深度1.2 mm；海马：向后3.5 mm，右侧旁开2.5 mm，深度3.0 mm。阴性对照组同法注射等量空载体腺相关病毒。之后于术后第1天开始，中药组和中药+ROCK2干扰组均给予温肺降浊方2 g/(kg·d)灌胃，其他组给予等量生理盐水灌胃，均1次/d，连续4周。

1.5观察指标及方法

1.5.1学习记忆功能 定位航行实验：术后1周、4周，每组大鼠每天上下午从4个象限各训练1次，将大鼠寻找平台的时间设置为120 s，记录大鼠从入水到爬上平台所需时间，即逃避潜伏期，以评估大鼠空间学习能力。 空间搜索实验：大鼠完成定位航行实验后进行空间探索实验，撤走平台，依次将大鼠从4个象限放入水中，分别记录其跨越原来平台的次数，以评估大鼠空间记忆能力。

1.5.2海马组织结构 术后4周，大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，断头，迅速取出脑组织，取2 mm×2 mm×2 mm大小的海马区组织1块，置于2.5%戊二醛预固定后加入1%锇酸继续固定，经70%、80%、95%乙醇及无水丙酮脱水，环氧树脂Epon812浸透和包埋，全自动石蜡切片机超薄切片，厚度约4 μm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜观察海马组织结构。

1.5.3海马神经细胞形态 选取含海马区的组织贴片后放入60 ℃烤片2 h，4%多聚甲醛溶液固定15 min，双蒸水冲洗2次，每次2 min；添加尼氏染色剂，37 ℃恒温箱孵育6 min，双蒸水冲洗2次，每次2 min；95%乙醇脱色脱水5 s，晾干中性树脂封片。各组每只大鼠随机选取3张切片在100倍视野下用Image-pro Express C图像分析系统对海马神经细胞形态进行观察。

1.5.4海马神经元细胞凋亡情况 用石蜡包埋切片机将海马组织标本切成5 μm厚的切片，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，用4%多聚甲醛液固定20 min，按照Tunel试剂盒说明书操作，以细胞核中有棕色颗粒为阳性细胞，即凋亡细胞，每组从不同大鼠中随机选取5张切片，每张切片在200倍光镜中选取5个不同视野，计数细胞凋亡数后取平均值。

2 结 果

2.1各组大鼠学习记忆能力比较 术后1周，模型组与各干预组大鼠逃避潜伏期均明显长于假手术组(P均<0.05)，穿越平台次数均明显少于假手术组(P均<0.05)，模型组与各干预组间逃避潜伏期、跨越平台次数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。术后4周，模型组和阴性对照组大鼠逃避潜伏期均明显长于假手术组(P均<0.05)，穿越平台次数均明显少于假手术组(P均<0.05)；与模型组比较，中药组、ROCK2干扰组及中药+ROCK2干扰组大鼠逃避潜伏期均明显缩短(P均<0.05)，跨越平台次数均明显增加(P均<0.05)；与ROCK2组及中药组比较，中药+ROCK2干扰组大鼠逃避潜伏期更短(P均<0.05)，穿越平台次数更多(P均<0.05)；中药组与ROCK2干扰组大鼠逃避潜伏期及跨越平台次数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 假手术组及血管性痴呆各组大鼠Morris水迷宫实验学习记忆能力比较

2.2各组大鼠海马区超微结构 假手术组突触结构正常且清晰，突触前膜有大量球形突触小泡，可见清晰的线粒体，突触间隙宽度及形态正常，突触后膜厚度正常且均匀；模型组与阴性对照组突触形态结构不完整，细胞器结构不清晰，突触小泡分布零散且形态模糊；中药组、ROCK2干扰组及中药+ROCK2干扰组突触结构清晰，前膜和后膜形态正常，可见清晰的线粒体结构，突触间隙宽度正常。见图1。

图1 假手术组及血管性痴呆各组大鼠术后4周海马区电镜下超微结构(×10 000)

2.3各组大鼠海马神经细胞形态 假手术组大鼠海马组织中神经元圆润饱满、排列整齐、结构完整，可见丰富的尼氏小体，尼氏小体计数(34.71±7.72)个；模型组和阴性对照组大鼠海马组织中神经元散乱，结构破坏，大量尼氏小体消失，尼氏小体计数分别为(13.58±3.55)个、(14.65±3.87)个，均明显少于假手术组(P均<0.05)；中药组、ROCK2干扰组、中药+ROCK2干扰组大鼠海马组织中神经元细胞排列整齐、结构完整，可见较丰富的尼氏小体，尼氏小体计数分别为(19.50±5.56)个、(20.34±5.49)个、(27.22±6.74)个，均明显多于模型组(P均<0.05)，且中药+ROCK2干扰组明显多于中药组与ROCK2干扰组(P均<0.05)，中药组与ROCK2干扰组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 假手术组及血管性痴呆各组大鼠术后4周海马组织尼氏染色表现(×100)

2.4各组大鼠海马细胞凋亡情况比较 假手术组、模型组、阴性对照组、中药组、ROCK2干扰组、中药+ROCK2干扰组大鼠海马细胞凋亡数分别为(4.39±1.60)个、(28.12±6.54)个、(29.52±5.58)个、(18.98±4.22)个、(19.38±4.07)个、(10.65±2.96)个，模型组、阴性对照组细胞凋亡数明显多于假手术组(P均<0.05)，中药组、ROCK2干扰组、中药+ROCK2干扰组细胞凋亡数明显少于模型组(P均<0.05)，且中药+ROCK2干扰组明显少于中药组与ROCK2干扰组(P均<0.05)，中药组与ROCK2干扰组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 假手术组及血管性痴呆各组大鼠术后4周海马细胞凋亡情况(×200)

3 讨 论

突触结构的可塑性是学习记忆的神经生物学基础[7]。突触连接可以完成神经元对信号的接收与处理功能，而神经系统的可塑性在很大程度上由突触形态结构、数量及功能状态决定[8]。神经元中的神经突触、轴突变化是神经退行性和神经保护的标志[9]，所以促进和保护神经突触的生长和神经细胞损伤后的修复在中枢神经系统疾病中的治疗显得尤为重要。研究已证实ROCK2可能参与神经突触异常、免疫炎性反应和神经变性，抑制ROCK2表达与改善炎症诱导的突触损伤及神经元凋亡密切相关[10]。ROCK抑制剂可以明显促进损伤后神经突触、轴突再生及功能恢复，从而可能成为一种新的疾病治疗途径[11]。Sung等[12]研究证实阻断RhoA或者ROCK的活性能够抑制Nogo对轴突生长的抑制作用，促进轴突再生和代偿性萌芽。在小鼠的局部脑缺血模型中，缺血皮质区ROCK快速激活，其抑制剂法舒地尔或Y-27632能够明显增加缺血半暗带和中心坏死区的脑血流量[13]。

本团队在国内首先提出“从肺论治痴呆”的新观点，并创制了温肺降浊方。该方附子与党参合用，温阳化气，既补益脾肺，更资肺卫宣发之源；干姜助附子温阳，滋肺生精；田七活血化瘀，亦有补益之功；大黄泻下降浊，荡涤肠胃，推陈致新；炙甘草补中缓急，调和药性。诸药合用，有温有补，有走有守，有升有降，各有兼顾。前期研究从线粒体相关凋亡蛋白表达、血管内皮功能方面证实该方可改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力及认知功能[14-15]。

体外RNA干扰为新兴的基因阻断技术，在人类基因功能研究及基因治疗方面显示出巨大前景，有望应用于神经损伤未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。腺相关病毒(AAV)载体具有较高的安全性、低免疫原性、可持续表达等特性，目前是神经系统研究以及基因治疗的重要工具之一[16]。本研究创新性地运用体外RNA干扰技术，探讨温肺降浊方的作用机制。结果发现温肺降浊方可能通过抑制ROCK2的表达，减少神经细胞凋亡，促进海马神经元再生，从而改善海马组织结构形态，减轻神经元损伤，这为血管性痴呆的中西医结合治疗提供了新的思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。