解郁止痛方对偏头痛抑郁共病大鼠行为学及脑组织脑源性神经营养因子表达的影响

冯思娜，舒星星，张 慧

(1. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2. 陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)

偏头痛是以反复发作的搏动样剧烈头痛为主要临床表现的神经血管疾病，并伴有恶心、呕吐等自主神经系统功能障碍的症状[1]。随着病情进展，偏头痛常反复发作，迁延难愈，逐渐转归为慢性偏头痛，其发生与抑郁等负性情绪相关[2]。流行病学研究显示，在偏头痛患者中抑郁症的患病率为41%～47%[3]，二者常相互影响、相互转化。偏头痛与抑郁症之间的高共病率提示两者之间可能具有相同的分子、环路机制，以及受到相同核团的调控[4]。影像学数据显示，前额叶皮质[5-6]、海马[7]、杏仁核[8]等在偏头痛患者和抑郁症患者中均发生明显改变。目前，对偏头痛抑郁共病缺乏正确的认识，对其发病机制了解匮乏。现有的偏头痛诊疗指南中对偏头痛抑郁共病并无公认的、有效的措施[9]，临床上多采用叠加方法治疗，不良反应大，效果不理想。重视偏头痛抑郁共病，寻找针对二者共同作用靶点的药物可能是偏头痛治疗并防治其慢性化、改善预后及生活状态、保证家庭社会劳动力的关键点及突破口。中医药治疗以辨证论治为特色，结合中药多靶点作用机制，对治疗偏头痛抑郁共病有独特优势，可减少西药用量,减轻不良反应,提高患者的生活质量[10-11]。解郁止痛方为导师总结的临床经验方，可行气活血、解郁止痛，治疗偏头痛抑郁共病疗效满意，但其机制尚不明确。相关基础研究显示，偏头痛抑郁共病模型大鼠血清、额叶皮质、海马中的脑源性神经营养因子(BDNF)显著降低，而杏仁核中的BDNF显著升高[12-13]。为了探索额叶皮质、海马与杏仁核在偏头痛抑郁共病中的不同作用机制，并更深层次探讨解郁止痛方有效改善偏头痛抑郁共病患者临床症状的分子机制，为临床提供有效理论依据，故进行了本次实验研究。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠48只，体重(200±15)g，北京斯贝福生物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010，动物使用许可证号：SYXK(陕)2021-0008。所有大鼠均饲养于陕西中医药大学实验动物中心，实验室温度维持在(22±2)℃，湿度维持在(50±10)%，噪声<60 dB，12 h光/暗循环，自由摄食、摄水。所有操作均符合动物处置伦理。

1.2药物与试剂 解郁止痛方(川芎12 g、柴胡10 g、合欢皮10 g、全蝎6 g、黄芪10 g)由陕西中医药大学附属医院中药房提供；硝酸甘油注射液(北京益民药业有限公司，国药准字H11020289，规格：5 mg/mL)；尼莫地平片(亚宝药业集团股份有限公司，国药准字H14022821，规格：20 mg/片)；多聚甲醛(博士德生物，批号：14J26068)；BDNF ELISA 试剂盒(博士德生物，产品批号：EK0308)。

1.3主要仪器 电子天平(上海民桥公司)，电子VonFrey测痛仪(美国ITLife Science公司2390系列)，冰冻离心机(EPPendrof 公司)，纯水仪(重庆艾科浦公司)，酶标仪(芬兰Labsystems公司，型号：MK3) 。

1.4实验方法 实验大鼠适应性喂养1周，经行为学测试后按照随机数字表法分为空白组、模型组、尼莫地平组、解郁止痛方高剂量组、解郁止痛方中剂量组、解郁止痛方低剂量组，每组8只。除空白组外，其余组均复制偏头痛抑郁共病模型。制备方法：在实验第1，7，14，21天于大鼠的颈背部皮下注射经生理盐水稀释后的硝酸甘油注射液10 mg/kg(硝酸甘油注射液5.0 mg/mL)诱发偏头痛发作，20 min后，大鼠可表现出异常行为变化，如耳部发红、躁动、前肢搔头动作频繁和攀笼次数增多。偏头痛模型复制后当天，各组大鼠进行慢性不可预测的刺激，包括7种刺激类型，每种刺激重复2～3次，相同条件刺激不可连续发生，使大鼠不能预测所接受的刺激。①夹尾：使用夹取力度相同且适中的鼠尾夹，在距大鼠尾巴根部1 cm处夹紧，时间2 min。 ②冰水游泳：准备装4 ℃冷水、水深15 cm的水桶，放入大鼠5 min后取出，期间保证大鼠的足尖可以碰到水桶的底部。③湿笼：在笼子里洒100 mL水，持续24 h。 ④禁食、禁水：禁食、禁水24 h。 ⑤晃笼：200 Hz 5 min。⑥昼夜反转：8：00—20：00，在确保通风的前提下，用不透明的罩布覆盖大鼠，20：00—次日8：00取下罩布，打开灯保持明亮的光照环境。⑦电击足底：0.9 mA，15 s×4次。实验期间，空白组和模型组大鼠正常进食进水，每天予以纯水灌胃；尼莫地平组予以尼莫地平混悬液6 mg/kg灌胃，解郁止痛方高、中、低剂量组分别给予解郁止痛方10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg (生药)灌胃，均1次/d，连续灌胃21 d。

1.5检测指标与方法

1.5.1机械痛阈测定 实验第1，7，14，21天造模前行机械痛阈值测定。将大鼠放置于底部具有网状金属孔格的透明测试笼中，在测试前预留15 min适应时间,使大鼠放松并保持相对静止。使用不同折力的Von Frey细丝刺激大鼠后爪的足底表面，引起爪子缩回的最小细丝被认为是阈值。每只动物测试3次，每次间隔时间为5 min，3次测试结果取平均值。

1.5.2行为学评分 实验第1天造模前及实验第10,21天进行以下实验。

1.5.2.1糖水消耗实验 实验前先对各组大鼠进行糖水摄入适应性训练，每笼放装有1%蔗糖水500 mL的2个水瓶。24 h后，同时给2个水瓶各装1%蔗糖水500 mL、纯水500 mL。24 h后，取走水瓶，记录大鼠的液体摄入量、糖水摄入量、纯水摄入量，计算糖水偏好百分率。糖水偏好百分率=糖水摄入量/总液体摄入量×100%。

1.5.2.2强迫游泳实验 将大鼠置于水温(24±1)℃、水深40 cm的圆桶(桶高50 cm、直径20 cm)中，强迫游泳10 min，记录大鼠的不动时间。大鼠在水中处于被动漂浮，同时停止挣扎3 s以上为不动状态。

1.5.2.3新奇抑制摄食实验 分别将大鼠放于50 cm×36 cm的盒子中，测试前1 d大鼠禁食、不禁水，在盒子中央放置大小相似的食丸，从敞箱的一个角放入大鼠，记录大鼠第一次咬食丸时间，即摄食的潜伏期。

1.5.3血清及额叶皮质、海马、杏仁核组织中BDNF含量 各项实验结束后，麻醉大鼠,心脏采血约3 mL，室温凝固30 min，1 500×g离心15 min，收集血清，分装后-80 ℃冷冻保存。断头取脑，分别提取大鼠的额叶皮质、海马及杏仁核，称重后放置1.5 mL离心管中，10 mg组织加入100 μL蛋白裂解液(每1 mL裂解液加入10 μL PMSF)，放置在冰上。将裂解后的样品(10 000～14 000)×g离心3～5 min，取上清液至新1.5 mL离心管，切勿吸取沉淀，蛋白样品放入-80 ℃冻存。BDNF浓度测定均严格按照ELISA试剂盒说明执行。

2 结 果

2.1各组大鼠机械痛阈值比较 实验第1天造模前，各组大鼠机械痛阈值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。实验第7，14，21天造模前，模型组大鼠机械痛阈值均明显低于空白组(P均<0.05)，且随着病程的进展，机械痛阈值逐渐降低；与模型组比较，尼莫地平组及解郁止痛方各组大鼠机械痛阈值均明显升高(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组及偏头痛抑郁共病各组大鼠后爪机械痛阈值比较

2.2各组大鼠糖水偏好百分率比较 实验第1天造模前，各组大鼠糖水偏好百分率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。实验第10，21天，模型组大鼠糖水偏好百分率均明显低于空白组(P<0.05)；尼莫地平组及解郁止痛方各组大鼠糖水偏好百分率均明显高于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2 空白组及偏头痛抑郁共病各组大鼠糖水偏好百分率比较

2.3各组大鼠强迫游泳不动时间比较 实验第1天造模前，各组大鼠强迫游泳不动时间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。实验第10天，模型组大鼠强迫游泳不动时间明显长于空白组(P<0.05)；尼莫地平组及解郁止痛方各组大鼠强迫游泳不动时间均明显短于模型组(P均<0.05)，解郁止痛方中剂量组降低最为明显。实验第21天，模型组大鼠强迫游泳不动时间明显长于空白组(P<0.05)；尼莫地平组及解郁止痛方中、高剂量组大鼠强迫游泳不动时间均明显短于模型组(P均<0.05)，解郁止痛方低剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 空白组及偏头痛抑郁共病各组大鼠强迫游泳不动时间比较

2.4各组大鼠新奇抑制摄食潜伏时间比较 实验第1天造模前，各组大鼠新奇抑制摄食潜伏时间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。实验第10天，模型组大鼠新奇抑制摄食潜伏时间明显长于空白组(P<0.05)；解郁止痛方中剂量组大鼠新奇抑制摄食潜伏时间明显短于模型组(P<0.05)；尼莫地平组及解郁止痛方低、高剂量组大鼠新奇抑制摄食潜伏时间有缩短趋势，但与模型组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。实验第21天，模型组大鼠新奇抑制摄食潜伏时间明显长于空白组(P<0.05)；尼莫地平组及解郁止痛方中剂量组大鼠新奇抑制摄食潜伏时间均明显短于模型组(P均<0.05)，而解郁止痛方低、高剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 空白组及偏头痛抑郁共病各组大鼠新奇抑制摄食潜伏时间比较

2.5各组大鼠血清及额叶皮质、海马、杏仁核组织中BDNF含量比较 实验第21天干预结束后，模型组大鼠血清及额叶皮质、海马组织中BDNF含量均明显低于空白组(P均<0.05)，杏仁核组织中BDNF含量明显高于空白组(P<0.05)。尼莫地平组、解郁止痛方中剂量组大鼠血清、额叶皮质、海马组织中BDNF含量及解郁止痛方低剂量组大鼠血清中BDNF含量均明显高于模型组(P均<0.05)，尼莫地平组及解郁止痛方各剂量组杏仁核组织中BDNF含量均明显低于模型组(P均<0.05)；解郁止痛方低剂量组大鼠额叶皮质、海马组织中BDNF含量及解郁止痛方高剂量组大鼠血清、额叶皮质、海马组织中BDNF含量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表5。

表5 空白组及偏头痛抑郁共病各组大鼠实验第21天干预结束后血清及额叶皮质、海马、杏仁核组织中BDNF含量比较

3 讨 论

头痛与郁证有着相同的病机，均与肝失疏泄、脾失健运密切相关，又与病理产物瘀血、痰湿合而为病[14]。临床上情绪波动是诱发偏头痛慢性化的重要因素，故肝失疏泄在偏头痛抑郁共病的发展进程中起着关键作用。由于情志不调，气机郁滞，不能推动血液运行而产生瘀滞；气化失司，痰湿内停，上扰清窍，均致不通则痛。头痛日久不愈，病者忧闷不解，加之久痛入络，气滞既生，易导致肝气郁结，疏泄不畅。故临证头痛未愈，又见心情抑郁、情绪不畅等症，二者相互影响，易成头痛、郁证并重。头痛、抑郁相互影响，迁延难愈，久病则虚，遂成本虚标实之气滞血瘀正虚之证，患者常以头痛经年迁延不愈，继而并见以情绪低落为主的郁证为临床特征。总结其病因病机，慢性头痛并抑郁状态当属中医“内伤头痛”“郁证”范畴。

解郁止痛方是治疗偏头痛的验方，方中川芎、柴胡为君药，川芎辛温香燥，走而不守，具有活血祛瘀、行气开郁、散寒止痛之功。张元素称誉川芎“上行头目，下行血海”，它既可行血中之气以解郁，又可祛血中之风而止痛。柴胡味辛，本以疏肝解郁、调畅情志见长，方中又取其入经理气，以止头痛；辅以合欢皮解郁、和血、宁心；全蝎为搜风通络之品，长于病久入络，尤迁延日久之慢性头痛；《景岳全书·古头痛第及》中认为“凡诊头痛者……盖暂头痛，必因邪气，久病者，必兼元气。”该证由头痛迁延，并发郁证，病久势必伤及正气，故用黄芪大补元气。五味合力，达理气活血、扶正补气之功。解郁止痛方治疗慢性头痛合并抑郁状态，立法组方本于该病的基本病机，临床应用证实其疗效可靠。

BDNF是中枢和外周神经系统内的神经营养因子，可控制神经元的发育和分化。BDNF主要由神经元和星形胶质细胞以自分泌、旁分泌方式分泌，广泛存在于额叶皮质、海马、杏仁核等中枢神经系统中[15]。目前研究发现，BDNF部分通过影响谷氨酸能和γ-氨基丁酸能突触的效率来调节三叉神经伤害感受通路中突触的可塑性，其是偏头痛抑郁共病的重要调节因子，BDNF/酪氨酸激酶受体B(TrkB)信号通路激活后，可通过细胞内的级联反应导致中枢敏化[16-17]。当疼痛上行通路逐级上传至丘脑伤害感受性神经元，则会出现颅外痛觉超敏，从而造成偏头痛的慢性化[18]。杏仁核主要包括中央杏仁核(CeA)和基底外侧复合体(BLA)。BLA中主要是兴奋性的谷氨酸能神经元，CeA中主要是抑制性的γ-氨基丁酸能神经元[19]。关于杏仁核的环路连接已经有很多报道，CeA的外侧部分被称为“伤害感受性杏仁核”，从脑干和脊髓接收伤害感受性输入，CeA将疼痛的认知和意识感知整合之后，将信号输出发送到皮质部位和丘脑[19]。BLA与皮质区域相互连接，尤其是额叶皮质、海马以及感觉相关区域。

本实验结果显示，解郁止痛方可显著改善偏头痛抑郁共病大鼠的行为，降低杏仁核中BDNF含量，升高血清、额叶皮质、海马中BDNF含量。推测解郁止痛方可能通过影响BDNF/ERK/CREB信号通路，降低疼痛上行传导通路的中枢敏化，抑制杏仁核的过度活化，从而减轻其对额叶皮质及海马的负性调节而发挥镇痛作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。