Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡在COPD 患者肺损伤中的作用及机制研究

顾 超 陶 峰 曹林峰 李 娜 应 樱 张 齐 马肖龙

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是全球三大死因之一，其中90%的死亡发生在中低收入国家[1]。COPD 的发病机制非常复杂，目前尚未完全阐明。氧化应激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、炎症反应、细支气管周围和间质纤维化及细胞衰老等介导了COPD 的发生发展[2-6]。我们的前期研究发现，在吸烟诱导的肺气肿模型大鼠肺组织中Ⅱ型肺泡上皮细胞（type Ⅱ alveolar epithelial cells，AECⅡ）凋亡明显增加，进而导致其肺功能下降[7]，但具体的作用机制尚不明确。本研究通过收集临床患者的肺组织，分析COPD 患者肺损伤的相关分子机制，为阐明COPD 发病机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年1 月至2020 年12 月在浙江省嘉兴市第一医院手术治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者30 例，分为NSCLC 不伴COPD 且无吸烟史的患者（A 组）、NSCLC 不伴COPD 但有吸烟史的患者（B 组）及NSCLC 伴COPD 且有吸烟史的患者（C 组），每组10 例。本研究经医院伦理委员会审核通过（审批号：LS2020-139），所有患者或家属均签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准 参考本课题组前期研究[8]，COPD 伴NSCLC 患者纳入标准：（1）符合COPD 诊断标准，且第1 s 用力呼气容积/用力肺活量（FEV1/FVC）<70%，50%≤FEV1<80%的预计值；（2）符合NSCLC 诊断标准，TNM 分期为ⅠA-ⅡB 期，拟行肺癌手术治疗；（3）2 周内无COPD 急性加重史，无支气管哮喘病史。NSCLC 且不伴COPD 患者纳入标准：（1）符合IASLC 2009 年NSCLC 诊断标准，TNM 分期为ⅠA-ⅡB 期；（2）无COPD、支气管哮喘等慢性气道疾病；（3）拟行肺癌手术治疗。排除标准：（1）存在除NSCLC 以外其他恶性肿瘤史者；（2）存在心、肝、脑等的重要脏器功能不全的患者；（3）有血液系统相关疾病或者严重凝血功能障碍患者；（4）使用全身糖皮质激素、化疗药物治疗者。标本选取距肺癌病灶切缘5 cm 外的肺组织，-80℃保存或4%甲醛固定。

1.3 主要试剂 PrimeScriptTMRT Kit with gDNA Eraser 试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（日本TaKaRa，批号RR047A）、SP-9000 免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号SP02991）、兔抗人肺泡表面活性蛋白A（SPA）抗体（美国Santa Cruz，批号sc-166219）、兔抗人肺泡表面活性蛋白C（SPC）抗体（美国Santa Cruz，批号sc-518029）、兔抗人p53 抗体（江苏碧云天公司，批号AF7671）、兔抗人p21 抗体（江苏碧云天公司，批号AF5252）、兔抗人叉头框蛋白O3a（FoxO3a）抗体（江苏碧云天公司，批号AF609）、山羊抗兔IgG 二抗（杭州华安生物技术有限公司，批号HA1101）、TUNEL凋亡细胞检测试剂盒（江苏碧云天公司，批号C1090）、TRIzol（美国Invitrogen 公司，批号15596026）。

1.4 方 法

1.4.1 肺功能测定 患者手术前常规采用耶格MasterScreen 肺功能仪进行肺功能测定，采集数据FVC、FEV1/FVC 和FEV1占预计值的百分比（FEV1%），分析并打印报告。

1.4.2 肺组织病理学检测 各组患者肺组织于4%甲醛中固定，参考本课题组前期研究方法[9]行HE 染色，并分析肺泡的平均内衬间隔（MLI）、平均肺泡面积（MAA）和单位面积平均肺泡数（MAN）。

1.4.3 Real-time PCR 检测SPA 和SPC mRNA 表达参考本课题组前期研究方法[9]检测肺表面活性蛋白A（SPA）和肺蛋白活性蛋白C mRNA（SPC mRNA）表达水平。

1.4.4 免疫组化检测SPA 和SPC 蛋白表达 各组肺组织石蜡包埋后切片，脱蜡至水，抗原修复后予山羊血清封闭，加SPA 或者SPC 一抗孵育，洗涤后加山羊抗兔IgG 二抗孵育，最后DAB 显色及苏木素复染，封片后显微镜下观察。

1.4.5 TUNEL/SPC 双重免疫荧光染色 各组肺组织石蜡包埋后切片，脱蜡至水，蛋白酶K 消化后加SPC一抗孵育，漂洗后加FITC 标记的IgG 二抗孵育，洗涤后加TUNEL 检测液避光孵育，最后予DAPI 复染，荧光显微镜下观察，并参考本课题组前期研究方法[10]，计算TUNEL 及SPC 双阳性细胞的百分比，即为凋亡的AECⅡ。

1.4.6 Western blot 检测p53、p21 及FoxO3a 蛋白表达 取各组肺组织采用组织蛋白提取试剂盒提出总蛋白，总量为20 μg 的蛋白变性后上样电泳，转膜后封闭，加p53、p21 及FoxO3a 一抗孵育，漂洗后加山羊抗兔IgG 二抗孵育，成像系统扫描摄像后分析目的蛋白表达量。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0 软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，以上实验结果均重复3 次及以上，采用单因素方差分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组NSCLC 患者肺功能结果比较 各组患者手术前均测定肺功能，FVC 结果相近，差异无统计学意义（P>0.05）。与A 组比较，C 组FEV1/FVC 和FEV1%均明显降低（P<0.05）；与B 组比较，C 组FEV1/FVC 和FEV1%均明显降低（P<0.05）。见表1。

表1 各组NSCLC 患者肺功能测定结果比较（）

表1 各组NSCLC 患者肺功能测定结果比较（）

注：A 组为NSCLC 不伴COPD 且无吸烟史的患者；B 组为NSCLC 不伴COPD 但有吸烟史的患者；C 组为NSCLC 伴COPD 且有吸烟史的患者；FVC 为用力肺活量；FEV1 为第1 s 用力呼气容积；FEV1/FVC 为第1 s 用力呼气容积与用力肺活量之比；NSCLC 为非小细胞肺癌；COPD为慢性阻塞性肺疾病；与A 组比较，aP<0.05；与B 组比较，bP<0.05

2.2 肺组织病理学改变 各组患者肺组织HE 染色后显示，C 组肺组织呈现明显的肺气肿样病理学改变（见图1）。同时，肺组织病理学半定量分析表明，A组和B 组的MLI、MAA 及MAN 无明显差异（P>0.05）。与A 组和B 组比较，C 组的MLI 和MAA 均明显升高（P<0.05）、MAN 明显降低（P<0.05）；C 组患者的肺组织病理学改变与肺功能下降相符合。见表2。

表2 各组NSCLC 患者肺组织MLI、MAA 和MAN 结果比较（）

表2 各组NSCLC 患者肺组织MLI、MAA 和MAN 结果比较（）

注：A 组为NSCLC 不伴COPD 且无吸烟史的患者；B 组为NSCLC 不伴COPD 但有吸烟史的患者；C 组为NSCLC 伴COPD 且有吸烟史的患者；NSCLC 为非小细胞肺癌；COPD 为慢性阻塞性肺疾病；MLI 为肺泡的平均内衬间隔；MAA 为平均肺泡面积；MAN 为单位面积平均肺泡数；与A 组比较，aP<0.05；与B 组比较，bP<0.05

图1 各组NSCLC 患者肺组织病理学改变（HE 染色×200）

2.3 各组NSCLC 患者肺组织SPA 和SPC mRNA 及蛋白表达水平比较 分别采用Real-time PCR 和免疫组化检测各组患者肺组织SPA 和SPC mRNA 及蛋白表达水平。结果显示，A 组和B 组患者肺组织SPA 和SPC mRNA 及蛋白表达水平相近，差异无统计学意义（P>0.05）。与A 组和B 组比较，C 组SPA mRNA 和SPC mRNA 表达水平显著降低（P 均<0.05）。C 组SPA 和SPC 蛋白表达明显减少。见表3、图2-3。

图2 各组NSCLC 患者肺组织SPA 蛋白表达水平（免疫组化×400）

图3 各组NSCLC 患者肺组织SPC 蛋白表达水平（免疫组化×400）

表3 各组NSCLC 患者肺组织SPA 和SPC mRNA 表达水平比较（）

表3 各组NSCLC 患者肺组织SPA 和SPC mRNA 表达水平比较（）

注：A 组为NSCLC 不伴COPD 且无吸烟史的患者；B 组为NSCLC 不伴COPD 但有吸烟史的患者；C 组为NSCLC 伴COPD 且有吸烟史的患者；NSCLC 为非小细胞肺癌；COPD 为慢性阻塞性肺疾病；SPA 为肺泡表面活性蛋白A；SPC 为肺泡表面活性蛋白C；与A 组比较，aP<0.05；与B 组比较，bP<0.05

2.4 各组AECⅡ凋亡水平比较 TUNEL/SPC 双重免疫荧光染色检测各组患者肺组织AECⅡ的凋亡，TUNEL（红色荧光）和SPC（绿色荧光）双阳性的细胞即为凋亡的AECⅡ。与A 组和B 组相比，C 组AECⅡ凋亡百分比显著增加（P<0.05）。见图4、表4。

图4 各组NSCLC 患者肺组织AECⅡ凋亡比较（TUNEL/SPC 双重免疫荧光×640）

表4 各组NSCLC 患者肺组织AECⅡ凋亡百分比比较（%，）

表4 各组NSCLC 患者肺组织AECⅡ凋亡百分比比较（%，）

注：A 组为NSCLC 不伴COPD 且无吸烟史的患者；B 组为NSCLC 不伴COPD 但有吸烟史的患者；C 组为NSCLC 伴COPD 且有吸烟史的患者；NSCLC 为非小细胞肺癌；COPD 为慢性阻塞性肺疾病；TUNEL为脱氧核糖核苷酸末端转移酶；AECⅡ为Ⅱ型肺泡上皮细胞；与A 组比较，aP<0.05；与B 组比较，bP<0.05

2.5 各组p53、p21 及FoxO3a 蛋白表达变化 Western blot 实验结果显示，p53、p21 及FoxO3a 蛋白在A组和B 组中的表达相近；与A 组和B 组比较，C 组患者肺组织p53 和p21 蛋白表达量明显增加（P<0.05）、FoxO3a（F=288.318，P=0.000）蛋白表达量显著降低（P<0.05），见图5、表5。

图5 各组NSCLC 患者肺组织p53、p21 及FoxO3a 蛋白表达变化

表5 各组NSCLC 患者肺组织p53、p21 及FoxO3a 蛋白相对表达量比较（%，）

表5 各组NSCLC 患者肺组织p53、p21 及FoxO3a 蛋白相对表达量比较（%，）

注：A 组为NSCLC 不伴COPD 且无吸烟史的患者；B 组为NSCLC 不伴COPD 但有吸烟史的患者；C 组为NSCLC 伴COPD 且有吸烟史的患者；NSCLC 为非小细胞肺癌；COPD 为慢性阻塞性肺疾病；FoxO3a为叉头框蛋白O3a；与A 组比较，aP<0.05；与B 组比较，bP<0.05

3 讨论

COPD 的特征是持续的呼吸道症状和不可逆气流受限，通常是由于大量接触有毒颗粒物或气体引起的气道和/或肺泡的异常，并受到包括肺发育异常在内的宿主因素的影响[11]。吸烟是COPD 最常见的危险因素，与不吸烟者相比，吸烟者呼吸系统症状和肺功能异常的患病率更高，FEV1年下降率更高，COPD死亡率更高[12]。但即使是重度吸烟者，也只有不到50%的人患有COPD[13]。尽管遗传学可能在改变吸烟者患COPD 的风险方面发挥作用，但也可能涉及其他风险因素。本研究中纳入了NSCLC 不伴COPD 且无吸烟史的患者和NSCLC 不伴COPD 但有吸烟史的患者，两组患者在肺功能、肺组织病理学、SPA 和SPC mRNA 及蛋白表达、AECⅡ凋亡方面均无明显差异。

在哺乳动物中，肺泡上皮细胞由Ⅰ型肺泡上皮细胞（type Ⅰ alveolar epithelial cells，AECⅠ）和AECⅡ组成。AECⅡ可通过有丝分裂补充自身数量，合成并分泌肺表面活性蛋白（SPs），进而维持肺泡稳态、促进肺组织修复[14]。AECⅡ能特异性合成和分泌SPA 及SPC，并发挥相关功能[6]。因此，AECⅡ数量与功能的稳定对肺泡结构的完整性和维持肺功能具有重要作用。本研究中，COPD 患者（C 组）肺功能显著下降，符合COPD 诊断标准；肺组织呈现明显的肺气肿样病理学改变，并与肺功能下降相符合；进一步研究发现，COPD 患者肺组织SPA 和SPC mRNA 及蛋白表达水平显著低于A 组和B 组，并且TUNEL（红色荧光）和SPC（绿色荧光）双阳性细胞明显增多。因此，我们认为AECII 细胞凋亡介导了COPD 患者肺泡结构破坏和肺功能下降，并进一步导致肺损伤。

p53 是一种肿瘤抑制蛋白，可进一步激活p21 靶基因的转录和翻译、抑制细胞周期蛋白依赖的激酶活性，进而促进细胞凋亡[15]。Foxo3a 是Foxo 亚家族的一个重要成员，其被证实是参与细胞存活等重要生物学过程的基因调节因子[16]。在本研究中，我们发现COPD 患者肺组织中p53 和p21 蛋白表达明显上调、FoxO3a 蛋白表达显著下调。

因此，我们认为AECⅡ凋亡在COPD 患者肺损伤中起到重要作用，其机制可能与FoxO3a 蛋白表达下调及p53、p21 蛋白表达上调相关。如何抑制或者逆转COPD 患者AECⅡ细胞凋亡及其机制将有待进一步。[本研究由嘉兴市第一医院院级课题重点项目资助（No.2020YJZD017）。]