基于网络药理学和分子对接研究地黄饮子治疗老年衰弱综合征的活性成分及分子靶点

程雪桦，钱程，吴弢，陈洁，郭童杰，韩力

1.复旦大学附属华东医院中医科，上海 200040；2.复旦大学附属华东医院药剂科，上海 200040；3.上海市老年医学临床重点实验室，上海 200040；4.齐齐哈尔医学院药学院，内蒙古齐齐哈尔 161000

地黄饮子首见于《黄帝素问宣明论方》，方中熟地黄、山茱萸、肉苁蓉、巴戟天4 味君药可填精温肾、补养下元、收敛元气；附子、肉桂补火助阳、引火归元，麦冬、石斛滋阴生津，五味子酸涩固肾，伍肉桂能补火助阳，共为臣药；远志、石菖蒲、茯苓3 味化痰开窍兼健脑益智，是为佐药；生姜、大枣调药功兼佐使之用。地黄饮子治疗的病证范围较广，除治喑痱外，还用于中风及后遗症、暴喑、痿证、眩晕等治疗［1］。Lopez-Otin 等人［2］确定了9 种所谓的“衰老特征”，这些特征被广泛应用于衰老研究领域，其主要特征是基因组的不稳定、端粒的磨损、表观遗传学的改变和蛋白酶沉积剂的丧失。衰老细胞可以释放导致炎症和功能障碍的因子，随着年龄的增长和多种慢性疾病的病因部位积累，而地黄饮子含药脑脊液可显著上调Aβ 沉积导致的大鼠神经元及PC12 细胞的抗氧化酶（SOD、GSHPx 和过氧化氢酶）活性，降低MDA 水平，提高细胞抗氧化能力［3］。现代药理研究表明，地黄饮子还具有清除自由基，修复线粒体损伤，调节免疫功能以及抑制神经凋亡等多种抗衰作用［4］。老年衰弱核心是多器官系统生理储备力下降，从而对应激源的易感性增加［5］。老年人下元虚衰，阴阳两亏，虚阳上浮，痰浊随之上泛。本课题组临床发现，老年衰弱患者多兼夹痰湿之证，肾虚筋骨失养，故见筋骨痿软无力，有学者对运动性疲劳模型小鼠灌胃地黄饮子后发现小鼠的运动耐力、强度和负荷在一定程度上增强，运动疲乏可缓解［6］，此外，该方还有调节小鼠肾脏组织细胞周期的作用，可降低衰老小鼠肾脏组织P21、P53 蛋白及mRNA 表达进而延缓肾脏衰老［7］。

衰弱已被确定为老年致残的主要因素之一。根据欧洲SHARE 调查50 岁或以上居住在欧洲共同体的成年人中，超过50%的人合并衰弱或衰弱早期［8］。因此，本研究通过现代网络药理学的方法探讨多靶点干预老年衰弱综合征的药效物质基础和作用靶点进行广泛筛选具有重要意义。网络药理学是建立于高通量组学数据分析、网络数据库、计算机虚拟计算及网络拓扑结构分析策略的基础上来进行生物网络构建和分析，挖掘及预测中药复方确效成分、靶标蛋白以及疾病发生发展相关通路网络之间的潜在机制，与中医的整体观相契合。本研究运用TCMSP、TCMID、GeneCards 等数据库收集地黄饮子治疗老年衰弱的相关靶点，构建“中药-活性成分-交集靶点”网络、PPI 网络构建、富集分析等多层次生物信息网络，筛选出关键靶点和通路，为进一步开展地黄饮子治疗老年衰弱综合征的药理作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 地黄饮子活性成分的收集与筛选

本研究将地黄饮子15 味中药（肉苁蓉，熟地黄，巴戟天、山茱萸、麦冬、五味子、石斛、远志、石菖蒲、熟附子、肉桂、茯苓、生姜、大枣、薄荷）分别输入TCMSP 数据库（http：/ /tcmspw.com/tcmsp.php） 以 及TCMID（http：/ /47.100.169.139/tcmid/）数据库进行化学成分的查询，将化合物按照口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，类药性（Drug-Like，DL）≥0.18 进行筛选，从而筛选出具有高活性的潜在有效化学成分。

1.2 地黄饮子活性成分作用靶点和相关疾病靶点的搜集

在有机小分子数据库Pubchem （https：/ /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov） 数据库中整理地黄饮子的潜在有效化学成分的典型结构式Canonical SMILES 号，将整理到的SMILES 号分别输入成分靶点预测数据库Swiss Target Prediction（http：/ /www.swisstargetprediction.ch/），获取地黄饮子有效化学成分对应的靶点蛋白，根据Probability 指标筛选大于0 的靶点，得到地黄饮子有效化学成分的对应靶点。采用Gene Cards（https：/ /www.genecards.org/）数据库以“frailty in older adultls”、“frailty”、“aged”、“frailty syndrome”、“aging”作为关键词进行检索，获得与老年衰弱相关的靶点基因。

1.3 中药-成分-交集靶点网络与PPI 网络构建

将疾病靶点与成分靶点取交集，将交集靶点信息整理并导入Cytoscape3.9.0 软件，进行中药-成分-交集靶点网络图的构建。网络图中的节点分别代表了中药、成分、交集靶点蛋白。再将此交集靶点导入STRING （https：/ /string-db.org/）数据库获得蛋白-蛋白相互作用网络（Protein-Protein Interaction，PPI），将此网络导入Cytoscape3.9.0 软件进行优化以及网络拓扑分析。

1.4 GO 功能富集分析和KEGG Pathway 分析

为了进一步探索地黄饮子治疗老年衰弱在基因功能以及相关信号通路上的具体作用，利用DAVID数据库对地黄饮子-老年衰弱交集靶点进行KEGG 通路富集分析，基因本体GO 富集分析，其中GO 富集分析包含分子功能（Molecular Function）、生物过程（biological process）及细胞组成（cellular component） 3 个部分，设定阈值P＜0.01 具有统计学意义。选取前10个条目，并用微生信（http：/ /www.bioinformatics.com.cn/）在线绘图工具将其可视化。

1.5 分子对接

从pubchem 数据库（https：/ /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载地黄饮子活性化合物2D 结构的mol2格式文件，导入AutoDockTools-1.5.6 软件，将其修饰并保存为pdbqt 格式，作为对接配体。选取上述筛选的核心靶点，于Uniprot 数据库（https：/ /www.uniprot.org/） 寻找核心靶点的3D 构想，SRC、TP53、HSP90AA1、AKT1 的构体分辨率分别为2.20Å、1.24Å、2.12Å、2.46Å；将此3D 结构导入AutoDock-Tools-1.5.6 软件，进行去除水分子、加氢、加电荷及各项优化，作为分子对接受体。将配体与受体导入Auto Dock Vina 1.1.2 进行半柔性分子对接，得到其对接结果，再使用PyMOL 软件进行可视化。

2 结果

2.1 地黄饮子活性成分搜集与筛选

在TCMSP 数据库中分别查询地黄饮子的12 味组成成分肉苁蓉、熟地黄、巴戟天、山茱萸、五味子、石菖蒲、熟附子、肉桂、茯苓、生姜、大枣、薄荷这些中药的化学成分，在TCMID 数据库中查询麦冬、石斛、远志这3 味中药的化学成分，根据OB≥30%和DL≥0.18的筛选条件，剔除重复后得到157 个化学成分。

2.2 地黄饮子活性成分作用靶点和相关疾病靶点的搜集

将预测的157 个活性化合物导入Swiss Target Prediction 数据库中得到化合物相关的靶点，选取Probability＞0 的靶点去重，得到1 021 个靶点。通过GeneCards 关键词检索后获得与老年衰弱相关的靶点基因，将收集到的疾病靶点去重，按照Relevance score（Relevance score＞3.84）高于3 倍均值进行筛选得到2 056个靶点。将筛选到的这2 056个靶点与之前药物预测的1 021个靶点取交集得到393 个交集靶点，其韦恩图如图1所示，交集靶点包含IL6、TP53、PDGFRB、TNF、MAPT、ACE、VEGFA 等靶点。

图1 地黄饮子作用靶点与老年衰弱相关靶点交集Venn 图

2.3 中药-成分-交集靶点网络

地黄饮子的中药-成分-交集靶点网络图详见图2。此网络图红色菱形代表地黄饮子的15 味中药（以中文名称首字母大写代替），圆形黄色节点代表交集靶点，青色内四边形代表各味中药的有效活性成分。由于此复方制剂的网络复杂，成分繁多，故构建其“中药-成分”网络（图3）。其中地黄饮子的主要治疗成分有beta-sitosterol（β-谷甾醇）、sitosterol（谷甾醇）、Stigmasterol（豆甾醇）、quercetin（槲皮素），分别是5 味、4味、3 味、2 味中药共有的成分；且据图2可知，上述成分分别可与145、116、78、110 个靶点相互作用。成分作用的主要作用靶点有CYP19A1、AR、ESR2、BCHE、ESR1、PTPN1 等，可分别与71、69、65、61、60、59 个活性成分相互作用。

图2 中药-成分-交集靶点网络图

图3 中药-成分网络图

2.4 蛋白-蛋白相互作用网络（Protein-Protein Interaction，PPI）的构建

取交集所获取的393 个靶点导入STRING（https：/ /string-db.org/）数据库，获得各个蛋白之间的相互关系（置信度分数大于0.7，图4A）。将此相互关系数据导入Cytoscape3.9.1 软件中进行优化，此网络由382 个节点和2 902 条边组成，再将网络进行拓扑分析，度值排名前10 的靶点蛋白有SRC、TP53、HSP90AA1、AKT1、STAT3、MAPK3、EGFR、EP300、PIK3R1、IL6 （图4B）。

图4 蛋白-蛋白相互作用网络PPI 网络

2.5 靶点富集分析

基于地黄饮子-老年衰弱交集网络共筛选到393个靶点基因进行富集分析，根据其基因数目，取排名前10 的显著富集GO 功能和KEGG 代谢通路。如图5和图6所示。得到GO 条目998 条（P＜0.01），其中BP、CC、MF 分别有743、96、160 条，取排名前10 位的条目（图5）。其中BP 主要涉及转录的正调控、信号转导、凋亡过程的负调控等；CC 主要涉及质膜、细胞质、胞质溶胶、核等；MF 主要涉及蛋白质结合、相同的蛋白质结合、ATP 结合等；KEGG 通路富集分析共筛选了162 条（P＜0.01）信号通路，选取基因数目排名前20 的通路进行可视化（图6）。其中主要涉及癌症的通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、神经活性配体-受体相互作用、脂质和动脉粥样硬化等。见表1。

表1 KEGG 通路富集分析结果表（前10）

图5 地黄饮子治疗老年衰弱（CHD）靶点GO 功能分析（前10）

图6 地黄饮子作用靶点KEGG 富集分析的前20 条通路气泡图

2.6 分子对接

根据中药-成分-交集靶点网络、PPI 网络图以及Gene Cards 数据库筛选出的4 个核心靶点SRC、TP53、HSP90AA1、AKT1，将其与之前所预测的地黄饮子的4 个关键成分beta-sitosterol （β-谷甾醇）、sitosterol （谷甾醇）、Stigmasterol （豆甾醇）、quercetin （槲皮素）这4 个成分进行分子对接，总共进行16 次分子对接，最佳模式下，SRC 与β-谷甾醇、TP53 与槲皮素、HSP90AA1 与豆甾醇、AKT1 与β-谷甾醇的结合能分别为－7.9、－7.6、－7.4、－7.2 kcal/mol－1，取各个分子对接中良好的结果进行可视化构图（图7）。

图7 分子对接可视化图

3 讨论

衰弱综合征与多个生理系统的老化有关，认知障碍被认为是衰弱的一个组成部分。流行病学证据表明，衰弱可能与老年人的认知障碍、阿尔茨海默病、轻度认知障碍、血管性痴呆的病理学有关［9］。地黄饮子在临床上已长期用于治疗多种老年神经系统疾病，并表现出神经保护功能［10］。目前有学者对地黄饮子进行代谢组学分析和网络药理学研究，探讨了其关键代谢物及其相关代谢途径，发现地黄饮子所靶向的能量相关代谢途径的核心关键是对线粒体结构和功能的保护［11］。本研究采用网络药理学方法共筛选出地黄饮子根据筛选条件得到157 个化学成分和393 个交集靶点。其中地黄饮子的根据度值筛选出的主要治疗成分有beta-sitosterol（β-谷甾醇）、sitosterol（谷甾醇）、Stigmasterol（豆甾醇）、quercetin（槲皮素）分别是5味、4 味、3 味、2 味中药共有的成分。其中槲皮素属于类黄酮，黄酮类化合物具有广泛的生理活性且药理活性研究甚广，有研究发现［12］达沙替尼和类黄酮槲皮素的组合是一种有效的抗衰老药物，可以改善许多与年龄相关的疾病，包括衰弱、骨质疏松和心血管疾病。另一方面，本研究基于合理的网络药理学预测，对黄酮类化合物在中药方剂的合理性地位以及在网络图中的度值进行了综合分析考量，并经过分子对接证实了关键成分可以自发地与核心靶点相结合，确定其与相关蛋白确实有良好的结合能力。槲皮素的水溶性较差，生物利用度低，但已有研究通过降低结晶度、增加颗粒表面积或使用环糊精包合物来增加水溶性槲皮素，并且在人体中有较长的半衰期［13］，因此其仍有良好的应用前景。β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇属于植物甾醇类化合物（PSE），美国FDA、NCEP 等诸多机构推荐膳食中添加PSE 可以降低血脂水平，学者研究发现［14］补充PSE可有效降低内皮素-1 水平，而内皮素-1 浓度与血浆高LDL-c 水平密切相关，尤其是氧化型LDL，PSE 可通过调节脂质代谢的平衡抗主动脉衰老［15］。

地黄饮子的靶点类型多样，为了确定共有靶点之间的相互作用，本研究构建了PPI 网络，并根据度值筛选出前10 个核心靶点，即SRC、TP53、HSP90AA1、AKT1、STAT3、MAPK3、PIK3R1 等是地黄饮子治疗老年衰弱的关键靶点。Src 是一种蛋白酪氨酸激酶，它参与细胞多种关键的生理过程，在细胞生长、分裂、迁移和存活信号通路中发挥关键作用，也可以直接参与调节基因转录或核骨架结构，其表达及活性异常往往与乳腺癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤相关［16］。TP53 基因是编码肿瘤蛋白p53 的抑癌基因，是人类多种癌症中最常见的突变基因，p53 基因的活化对细胞凋亡通路起着至关重要的控制作用［17］，而p53/p21 信号通路的p21 和p53 是细胞周期的重要调节因子，当某种外界刺激作用到细胞时，p53 蛋白会出现应激性快速上调，正常的细胞周期受阻，细胞发生衰老。mTOR 通路是调控衰老的重要信号通路之一，有研究表明［18］PI3K-AKT/mTOR 信号通路在调节人血管平滑肌细胞的复制性衰老中起重要作用。STAT3 在细胞生长和凋亡等许多细胞过程中发挥关键作用，STAT3 的线粒体易位可抑制氧化应激诱导的自噬，并可有效保护线粒体免受有丝分裂吞噬的降解［19］。MAPK3 是一种丝裂原活化蛋白激酶，它们在包括氧化应激、DNA 损伤、癌症发展下被激活。HSP90 会调节某些表观遗传修饰物的活性调节从而对环境变化作出反应［20］。

基于地黄饮子-老年衰弱交集网络共筛选到393 个共有靶点显著富集于998 个GO 条目和145 条KEGG通路中（P＜0.01），地黄饮子治疗老年衰弱靶点GO 生物过程富集涉及转录的正调控、凋亡过程、细胞增殖、蛋白质结合等，这些生物过程在地黄饮子治疗老年衰弱中起到了关键作用。通过KEGG 富集分析显示，地黄饮子主要活性成分相关靶点涉及癌症通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、神经活性配体-受体相互作用、脂质和动脉粥样硬化等信号通路作用于衰弱。

研究发现［21］地黄饮子可以通过保护线粒体结构，来提高线粒体功能，从而促进三羧酸循环和氧化磷酸化进行，达到改善能量代谢的作用。线粒体自噬是一种自噬形式，可选择性地降解多余或受损的线粒体，在预防年龄相关疾病中起着关键作用，PI3K/AKT/mTOR 信号通路［22］可能通过调节线粒体自噬、线粒体生物合成等机制保证线粒体功能。本研究通过网络药理学的方法说明地黄饮子通过多成分、多靶点、多通路治疗老年衰弱，但有其一定的局限性。活性成分在衰弱患者体内的不同组织中分布差别缺乏对地黄饮子的定量检测和数学分析，可进一步利用液质联用技术分析地黄饮子化学物质基础及体内代谢，再结合体内外实验调控线粒体自噬、动脉粥样硬化等信号通路来明确地黄饮子有效性和安全性的评价。

综上所述，地黄饮子治疗老年衰弱综合征可能通过类黄酮槲皮素、植物甾醇类等活性成分与交集靶点（SRC、TP53、HSP90AA1、AKT1 等）来参与线粒体自噬、动脉粥样硬化、肿瘤等相关信号通路和生物细胞过程的调节，有必要对地黄饮子进行进一步的实验验证研究，探讨其关键作用机制。