不同灭菌方法对檀香清咽片生药粉灭菌效果及主要成分含量的影响

陈凤英 万 丹 邵国强 李跃辉 李鹏辉 扎西次仁 达瓦桑珠▲

1.湖南省澧县中医医院，湖南澧县 415500；2.湖南省中医药研究院，湖南长沙 410013；3.西藏自治区山南市藏医医院，西藏山南 856100

檀香清咽片是藏医专家加央伦珠从众多藏医经著中进行筛选，经多年临床实践提炼而成，由檀香、青藏龙胆、秦艽花等六味药组成，具有清热清肺、止咳化痰、解毒利咽功效，用于咽喉炎、支气管炎和呼吸道感染引起的咳嗽、咳痰、声音嘶哑、咽喉肿痛、胸背疼痛和气喘，也用于润喉亮嗓。临床檀香清咽方（堆慈巧门泥巴丸）原以药材粉碎后制成丸剂入药，应用过程中发现丸剂溶散性较差，故对其进行了工艺改进研究，制成片剂入药。

灭菌工艺作为影响药品质量的重要因素，往往会影响药品的安全性、有效性和稳定性[1]。中药及其制剂灭菌工艺方法很多，包括传统的湿热灭菌[2]、干热灭菌等，现代则主要包括辐射灭菌、微波灭菌和乙醇灭菌等[3]。目前，在中药中运用较多的灭菌方法为湿热灭菌和辐照灭菌[4]，因檀香清咽片中主要药效成分为挥发油和龙胆苦苷，干热灭菌不适用于含挥发油等热敏感药材[5]，含龙胆苦苷的药材不允许使用60Co辐照灭菌[6]，故本实验以檀香清咽片生药粉为研究对象，建立龙胆苦苷的含量测定方法，以灭菌率、挥发油和龙胆苦苷含量为考察指标，考察湿热灭菌、微波灭菌、乙醇灭菌3种灭菌方法对檀香清咽片生药粉的影响，筛选出有效、对药效成分破坏较小的灭菌方法，为檀香清咽片的生产工艺提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

Thermo UltiMate 3000高效液相色谱仪（Thermo Fisher）；101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；M1-L213B美的微波炉（广东美的厨房电器制造有限公司）；XPE105电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 实验材料

檀香、秦艽花、青藏龙胆等饮片均由西藏山南市藏医医院提供，经湖南省中医药研究院生药室鉴定均符合规定；龙胆苦苷对照品（批号：110770-201918，纯度为97.1%）由中国食品药品检定研究院提供；乙腈（色谱级，货号：34851）由Sigma提供，其他试剂为分析级试剂，水为纯化水。

1.3 实验方法

1.3.1 龙胆苦苷的含量测定 色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇∶0.1%磷酸溶液（20∶80）为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长为270 nm，柱温为30℃。

对照品溶液的制备：取龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.2 mg/ml的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取灭菌前的檀香清咽片生药粉约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 ml，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，取出后放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.2 挥发油的含量测定 称取檀香清咽片生药粉100 g，称定重量（准确至0.01 g），装入2000 ml圆底烧瓶中，加入10倍量水与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止，同时自冷凝管上端加乙醚2 ml，置电热套中缓慢加热至沸，并保持微沸约5 h，停止加热，放置1 h以上，放出乙醚层，将乙醚液置于已恒重的称量瓶中，在60℃以下挥干，称定称量瓶的重量，然后计算出挥发油的含量（%）。

1.3.3 灭菌率测定[7]采用平板计数法对制备的样品菌总数进行测定，参照《中华人民共和国药典》2020年版四部1105通则[8]项下的非无菌产品微生物限度检测法，计算灭菌率。

1.3.4 檀香清咽片生药粉灭菌方法

1.3.4.1 灭菌前样品的制备 按处方量比例称取檀香、秦艽花、青藏龙胆等饮片，粉碎过100目筛，制得檀香清咽片生药粉，备用。

1.3.4.2 湿热灭菌 按《中华人民共和国药典》2020年版四部1421通则[8]项下的湿热灭菌法，檀香清咽生药粉200 g，均匀平铺于托盘中，用牛皮纸包裹放置于立式蒸汽灭菌柜中，在121℃，15 min条件下进行灭菌。之后，将灭菌后的生药粉放入无菌真空干燥箱中，设置温度为60℃，真空抽滤2 h后密封样品。

1.3.4.3 微波灭菌 取檀香清咽片生药粉200 g，均匀平铺于托盘中，用牛皮纸包裹放置于微波炉中，在高火1 min条件下进行灭菌，灭菌后的样品密封。

1.3.4.4 乙醇灭菌 称取檀香清咽片生药粉200 g，量取75%乙醇，用量为物料的20%，将两者混合均匀后置于具塞锥形瓶中，放入60℃的恒温干燥箱，放置1.5 h，取出，将灭菌好的生药粉放入无菌真空干燥箱中，设置温度为60℃，真空抽滤2 h后密封样品。

2 结果

2.1 线性关系考察

称取龙胆苦苷适量，加甲醇稀释制成一系列浓度的对照品溶液，按1.3.1项下色谱条件分别进样5 μl，记录其峰面积，以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=0.1096x-0.1126，r=0.9992；表明龙胆苦苷在60.74576～607.4576μg/ml范围内具有良好的线性关系。

2.2 精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液5 μl，重复进样6次，测定样品中龙胆苦苷峰面积，RSD为0.24%，表明仪器精密度良好。

2.3 重复性试验

取本品样品6份，按照1.3.1项下制备供试品溶液的方法制备供试品溶液，测定样品含量，RSD为1.04%，表明本方法重复性较好。

2.4 稳定性试验

取供试品适量，分别于制备后0、2、4、8、12、16、20、24 h进样，测定其峰面积，RSD为0.66%，表明本方法稳定性较好。

2.5 加样回收试验

取已知含量的檀香清咽片生药粉9份，研细，取约2.5 g，精密称定，置锥形瓶中，分别加入低、中、高浓度对照品，精密加入80%甲醇50 ml，按“1.3.1”项下方法制备，按“1.3.1”项下的色谱条件进行测定，龙胆苦苷回收率为100.77%，RSD为2.47%。见表1。

表1 檀香清咽片加样回收率试验

2.6 不同灭菌方法对檀香清咽片生药粉灭菌率、挥发油、龙胆苦苷的影响

将灭菌前后的样品依次进行微生物限度、挥发油和龙胆苦苷含量测定，结果表明，不同的灭菌方法下檀香清咽片中挥发油及龙胆苦苷含量差异较大，微波灭菌与乙醇灭菌的檀香清咽片中挥发油含量与龙胆苦苷含量最高，而湿热灭菌的檀香清咽片中挥发油含量与龙胆苦苷最低，但从灭菌率看微波灭菌未达到《中华人民共和国药典》1107通则[8]中非无菌药用原料的微生物限度标准，故优选灭菌方式为乙醇灭菌。见表2，图1。

图1 不同灭菌方法处理后样品高效液相色谱（HPLC）图

3 讨论

龙胆苦苷为青藏龙胆、秦艽花的主要成分[9-10]，具有抑制炎症反应、抗氧化应激、抗纤维化、抗细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖等多种药理作用[11-15]。有研究表明秦艽和龙胆经辐照灭菌后会降低龙胆苦苷含量并影响药效作用[16]，国家食品药品监督管理总局于2005年发布的《中药辐照灭菌技术指导原则》中规定“龙胆、秦艽药材、饮片、药粉及含有龙胆、秦艽的半成品原粉不得辐照”，亦有研究表明经湿热、干热灭菌处理后对龙胆、秦艽药材中龙胆苦苷含量有影响[17]。由此可见，不同的灭菌方法对本品的药效成分有很大的影响，故本实验建立龙胆苦苷含量测定方法，以加强产品生产过程监测，稳定产品质量。

本实验结果显示，湿热灭菌及乙醇灭菌处理的样品灭菌率在99%以上，而微波灭菌未达到《中华人民共和国药典》通则1107中非无菌药用原料的微生物限度标准，说明以灭菌率为指标，乙醇灭菌与湿热灭菌效果相当。但2种灭菌方法处理的样品挥发油提取率及龙胆苦苷含量存在较大差异，其中采用湿热灭菌时，与未处理样品相比挥发油提取率下降了68.42%，龙胆苦苷的含量降低了44.18%，而乙醇灭菌处理的样品较未处理样品的挥发油提取率、龙胆苦苷含量无明显差异。这可能是湿热灭菌过程中，高温条件下导致挥发性成分挥发，而乙醇灭菌过程中，灭菌温度控制在60℃，不易导致挥发油挥发，更利于最大程度保留产品有效成分。乙醇灭菌技术是一种绿色环保的新型灭菌工艺[18]，具有较强的穿透力[19]，是利用乙醇渗透至微生物内使蛋白质变性的原理达到灭菌的目的。目前，已有设备厂家研制了乙醇灭菌器[20]，并在中药饮片灭菌过程中运用，得到了较好的灭菌效果，这也为本品的工业化生产提供了设备保障。本品还有待进一步积累数据，验证方法的可行性。