腐食酪螨Tyr p 34基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

王昱嘉 陈德盛 袁如意 钟永浩 刘晓宇

深圳大学过敏反应与免疫学研究所，广东深圳 518060

腐食酪螨（Tyrophagus putrescentiae）属于粉螨科（Acaridae），食酪螨属（Tyrophagus）[1]。其是常见的储藏物滋生螨，其尸体、皮壳、代谢产物和排泄物等会污染储存的食品[2]。人在接触、吸入甚至食用其滋生物后，可能会受到腐食酪螨的侵袭，引发人体螨病[3-4]。研究报道，腐食酪螨作为一种过敏原，能够引发遗传体质者发生由IgE介导产生的过敏反应，引起Ⅰ型变态反应性疾病[5]，如皮炎、过敏性鼻炎和过敏性哮喘等[6]。腐食酪螨分布广泛，对人类的正常生活和健康造成严重的影响，是继屋尘螨、粉尘螨后又一重要致敏螨种[7]。过敏原Tyr p 34（原名为Tyr p 24）由IgE筛选克隆取得，其含有153个氨基酸，相对分子质量为17.7 kDa。本实验对Tyr p 34重组蛋白进行克隆、表达、纯化，并对其进行过敏原鉴定，这将有助于腐食酪螨过敏性疾病患者的特异性诊治，具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与表达载体 大肠杆菌Rosetta（DE3）与表达载体pET-28a为本实验室构建并保存，能够有效结合并表达腐食酪螨重组蛋白Tyr p 34。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶BamH I和Xho I（生工生物工程股份有限公司）；RNA提取试剂（QIAGEN，奥格生物技术有限公司），反转录试剂盒（生工生物工程股份有限公司）；Ni-NTA resin及柱子（Amersham Pharmacia公司）。Western blot所用血清采集自深圳市罗湖区人民医院，经过敏原测试诊断为腐食酪螨过敏患者。血清采集均获得患者知情同意，所有血样标本的获取均得到医院医学伦理委员会的认可。

1.2 方法

1.2.1 腐食酪螨RNA的提取 选取实验室培养的活腐食酪螨，在液氮中浸泡、研磨，使用RNA提取试剂盒提取其总RNA。

1.2.2 扩增Tyr p 34基因 以提取的腐食酪螨的总RNA为反转录模板进行反转录，得到腐食酪螨的全部cDNA。根据已知Tyr p 34序列设计特异性引物，上下游引物分别为5’-GACCTTCGAGGAGAACGACC-3’；5’-TGGTAGGCAGGTTGGTAGGT-3’。根 据引物和cDNA进行PCR扩增，反应条件为95℃加热变性1 min，55℃冷却复性1 min，72℃延伸1.5 min，共进行30个循环。将PCR产物连接至克隆载体，再将此重组产物转化入E.coil Top10，在固体LB平板进行涂布过夜培养，挑选阳性单克隆扩增培养。待达到生长指数阶段时取样测序。

1.2.3 构建Tyr p 34重组表达菌 将得到的正确序列的质粒和表达载体pET-28a分别用BamH I及Xho I进行双酶切，将酶切产物连接得到重组质粒，将重组质粒转化进入E.coil Top10中，提取重组质粒进行双酶切鉴定。将鉴定为阳性的重组质粒转化至感受态大肠杆菌Rosetta（DE3）中，放入梯度扩增仪中扩增，涂板倒置过夜培养，待表面生长出白色微小圆形菌落，用封口膜密封后放进冰箱保存。

1.2.4 Tyr p 34少量诱导表达与蛋白鉴定 挑取单个菌落接种在含有Kana抗生素的LB培养基中，以37℃、150 rpm过夜振荡培养。取1 ml菌液，离心取其沉淀，标记为诱导前菌。向两个含有Kana的LB培养基中各加入2 ml菌液，分别标记为低温组（16℃）以及高温组（37℃）。取余下菌液进行保菌。将高温组及低温组放入37℃摇床中振荡培养（150 rpm、4 h），当细菌生长至对数生长期（OD600为0.6～0.8时），各加入终浓度为1 mol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白的表达。低温组诱导表达条件为16℃、125 rpm、20 h；高温组诱导表达条件为37℃、150 rpm、4 h，诱导表达成功后离心收集沉淀表达菌。经PBS裂解、冰浴超声波破碎、4℃离心后，收集得到低温组及高温组的上清、沉淀。将诱导前菌、低温组及高温组的上清、沉淀依次排列，沉淀重悬、加入上样缓冲液，沸水浴10 min后离心，进行SDS-PAGE电泳，观察蛋白的主要存在形式，发现Tyr p 34蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在，在高温组中含量相对较多。

1.2.5 重组蛋白Tyr p 34大量表达及纯化 取200 μl少量表达所保菌接种于含有Kana的LB培养基中过夜培养（37℃、150 rpm）。次日取50 ml菌液接种于1 L含有Kana的LB培养基中，放入37℃摇床中振荡培养后（200 rpm、2 h），加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导蛋白的表达（37℃、150 rpm、4 h）。离心收菌，加入B平衡液重悬，冰浴超声波破碎，离心，弃沉淀收集上清液至单个离心管保存于-20℃。取出冻存的上清液、解冻、离心（10000 rpm、30 min、4℃）。使用法玛西亚蛋白纯化仪纯化0.45过滤膜过滤后的上清液（NaOH 3 ml/min，ddH2O 3 ml/min，镍3 ml/min，ddH2O 3ml/min；B平衡液3 ml/min，上样2 ml/min；B平衡液3 ml/min，C平衡液3 ml/min，D平衡液3 ml/min），紫外吸收（UV）检测读数为200左右时收集洗脱液，洗柱。收集洗脱样品，进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.6 重组蛋白Tyr p 34的免疫印迹分析 将纯化后的重组蛋白Tyr p 34进行SDS-PAGE电泳，通过湿转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。使用含脱脂奶粉的TBST封闭2 h后，以确诊为腐食酪螨过敏的患者血清作为一抗，封闭孵育过夜。磷酸盐吐温缓冲液（PBST）清洗5次后（5 min/次），以辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgE作为二抗孵育1.5 h。再次用PBST清洗5次后（5 min/次），加入新配制的化学发光试剂（ECL）进行显色，在多功能化学发光成像仪中由显色结果判断重组后的Tyr p 34蛋白是否具有免疫原性。

1.2.7 Tyr p 34基因的生物信息学分析 运用ApE软件分析Tyr p 34基因序列，并推导其氨基酸序列。将该氨基酸序列与NCBI上发布的Tyr p 34氨基酸序列进行比对，分析其同源性。运用ProtParam预测其理化性质、KinasePhos分析其磷酸化位点。使用SWISS MODEL软件预测其三级结构。

2 结果

2.1 构建Tyr p 34重组表达质粒

构建重组质粒pET-28a（+）-Tyr p 34，对该质粒进行双酶切鉴定和琼脂糖凝胶电泳分析。在470 bp处有条带，与理论长度基本一致，证明重组表达质粒构建成功，见图1。

图1 重组质粒双酶切鉴定

2.2 Tyr p 34少量表达与蛋白鉴定

将鉴定为阳性的Tyr p 34重组质粒转入大肠杆菌Rosetta（DE3）中，诱导后进行蛋白鉴定分析。SDS-PAGE电泳结果显示Tyr p 34基因成功表达。诱导后蛋白表达量增高，在分子质量约为20 kDa处可见明显条带；蛋白在高温组中含量相对较多，上清液中可见明显条带，沉淀中未见明显条带，提示Tyr p 34蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在，见图2。

图2 Tyr p 34重组蛋白的SDS-PAGE分析

2.3 Tyr p 34大量表达与纯化

高温条件下大量诱导表达Tyr p 34蛋白，收集上清液进行纯化，取样进行SDS-PAGE电泳，可见纯化后的蛋白纯度较高，在分子质量约为20 kDa处可见明显条带，该条带的蛋白分子质量与Tyr p 34蛋白的理论分子质量基本相符，见图3。

图3 纯化后Tyr p 34蛋白SDS-PAGE

2.4 重组蛋白Tyr p 34免疫原性鉴定

Western blot结果显示，在理论值处可见条带，说明重组蛋白Tyr p 34可与腐食酪螨过敏病患血清中的IgE特异性结合，表明其具有免疫原性。对照组正常人血清中不含抗腐食酪螨特异性IgE抗体，无法与重组蛋白结合，图中未见明显条带。见图4。

图4 腐食酪螨Tyr p 34 Western blot检测

2.5 Tyr p 34基因测序及比较分析

运用ApE软件分析克隆Tyr p 34基因，获取其氨基酸序列。结果显示该基因大小为462 bp，编码153个氨基酸，见图5。将该氨基酸序列与NCBI发布的Tyr p 34氨基酸序列（登录号：ACL36923.1）进行比对，同源性为99%，有一个氨基酸的差异，见图6。

图5 Tyr p 34 的cDNA序列

图6 序列比对

2.6 Tyr p 34的理化性质与磷酸化位点

使用ProtParam软件分析腐食酪螨Tyr p 34的理化性质。结果显示，该蛋白分子式为C765H1200N194O266S10；相对分子质量为17691.68 Da；总原子数为2435；理论等电点为4.04；氨基酸组成中谷氨酸最高，占比为15%；不稳定系数为41.13，预测该蛋白性质不稳定；脂肪系数为78.43；总平均亲水性为-0.516。使用KinasePhos分析其磷酸化位点，示Tyr p 34蛋白含有1个苏氨酸激酶（T），为第122位氨基酸；2个丝氨酸激酶（S），为第7、62位氨基酸；2个酪氨酸激酶（Y），为第28、104位氨基酸。

2.7 Tyr p 34蛋白的三级结构

使用SWISS MODEL软件对序列建模，得到三维结构图，见图7，表明该蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。

图7 Tyr p 34的三级结构

3 讨论

腐食酪螨过敏原使用世界卫生组织和国际免疫学会联合会过敏原命名小组委员会制定的系统过敏原命名法命名。根据该命名规范，前三个字母表示过敏原的来源，第四个字母为种名第一字母[8-9]。当前已被命名的腐食酪螨过敏原共有10个，包括Tyr p 2、Tyr p 3、Tyr p 8、Tyr p 10、Tyr p 13、Tyr p 24（已更名为Tyr p 34）、Tyr p 28、Tyr p 35、Tyr p 36和α-Tubulin[7]。Jeong等[10]研究发现Tyr p 34属于肌钙蛋白C，是一种新的螨过敏原。该过敏原与其他螨类的氨基酸序列同源性均在64%以上，发现在47名尘螨过敏患者受试者中只有5名（10.6%）血清与Tyr p 34发生IgE反应，证明Tyr p 34为次要过敏原。

研究显示，腐食酪螨与屋尘螨和粉尘螨有共同抗原可引发人类过敏性疾病[11]。目前，临床上治疗粉螨过敏患者的有效措施是寻找过敏原，并进行特异性免疫治疗（SIT）[12]。SIT也称为脱敏治疗，通过向Ⅰ型变应性疾病患者注射或以其他途径给予特异性致敏的过敏原，持续并逐渐递增药量，使患者对过敏原适应和耐受，并逐渐减少或消除过敏原引发的临床症状[13-14]。进行SIT时，传统上采取尘螨粗浸液，但其含有其他未知的过敏原成分，可能引起患者过敏，存在提取复杂、安全性低等缺点。重组蛋白疫苗是通过诱导含有特异性抗原基因的细胞表达目的蛋白，对该重组蛋白进行纯化并进一步修饰而制备得来的疫苗。具有纯度高、产量高、安全稳定的特点。据报道，过敏原疫苗治疗已成为过敏性疾病如过敏性鼻炎治疗的重要方案之一[15]。因此，研究腐食酪螨的相关过敏原成分，对其蛋白进行纯化及免疫原性鉴定，有利于腐食酪螨重组蛋白疫苗的制备。

据文献报道，尘螨为诱发过敏性鼻炎、哮喘的主要过敏原[16]。别国梁等[17]对280例过敏性鼻炎患者进行分析，发现尘螨阳性率为75.36%，该类疾病严重影响了患者的正常生活及健康。此外，腐食酪螨所致的相关变态反应性疾病的治疗需求也日益迫切。

本研究提取腐食酪螨Tyr p 34总RNA，通过RT-PCR得到克隆基因，并构建重组质粒。诱导该基因表达出重组蛋白并纯化，进行免疫印迹分析鉴定其免疫原性及生物信息学分析。以上信息能够为Tyr p 34重组变应原的疫苗制备、免疫诊断和特异性免疫治疗等临床应用研究提供理论参考。