miR-365a-3p通过BMI1基因影响结直肠癌干细胞特性抑制结直肠癌发生发展的机制研究

何 涵 冶亚平 阴常欣 周玲玲 昌 媛 李婷婷▲

1.南方医科大学南方医院血液科，广东广州 510515；2.南方医科大学基础医学院病理学系，广东广州 510515

结直肠癌是全球高发的恶性肿瘤之一，严重威 胁人类生命健康[1]，阐明结直肠癌发生的分子机制，对结直肠癌进行早期诊断和预后评估是结直肠癌研究的重要内容。

肿瘤组织中存在具有自我更新和不断增殖能力的细胞，在肿瘤的发生、发展和转移中起着重要的作用，这些细胞被称为肿瘤干细胞（tumor stem cell，TSC）[2]。TSC极强的运动和迁徙能力能促进肿瘤细胞转移[3]。B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1（B-lymphoma Moloney murine leukemia virus insertion site-1，BMI1）基因是多梳基因家族中重要的调控基因，在维持肿瘤干细胞的自我更新及多向分化的过程中起着重要作用[4-6]。BMI1的过表达可以促进肠癌的增殖并诱导癌细胞出现化疗抵抗[7]。

本研究发现miR-365a-3p可以靶向结合BMI1，而miR-365a-3p在结直肠癌中的作用在国内外少见报道，本研究通过检测miR-365a-3p在结直肠癌组织中的表达，观察其对结直肠癌细胞增殖能力和干细胞特性的影响，明确其抑制结直肠癌发生的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂仪器及细胞株

1.1.1 试剂 血清（美国Gibco）；逆转录试剂盒（日本宝生物），PCR试剂盒（日本宝生物）；BMI1质粒、miR-365a-3p、抑制剂及其空白对照均购自广州锐博生物公司；CCK8（东仁公司）。

1.1.2 仪器 CO2孵箱（上海润度）；显微镜（德国莱卡）；离心机（德国艾本德）；酶标仪（深圳汇松）；紫外分光光度计（上海箐华）。

1.1.3 细胞株 HCT15和SW620购自美国ATCC公司。

1.2 临床标本收集

收集南方医院2018年9月至2019年9月住院患者的结直肠癌标本，本研究已通过医院医学伦理委员会批准。

1.3 提取RNA

按照试剂说明书提取RNA，通过紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度。

1.4 Q-PCR

①按照试剂盒说明书逆转录提取好的RNA。②用PCR试剂盒检测miR-365a-3p和基因的表达，引物序列见表1。反应条件：95℃ 6 min、95℃ 15 s、60℃ 32 s、72℃ 32 s，40个循环。U6及GAPDH为内参，重复3次。

表1 引物序列

1.5 荧光素酶报告实验

①利用在线网站TargetScanHuman 7.2预测miR-365a-3p的靶基因。②构建BMI1野生型及突变型的荧光素酶载体，分别与对照组（空白）、实验组（miR-365a-3p）、干扰组（miR-365a-3p抑制剂）共转染至结肠癌细胞。48 h后，按荧光素酶报告系统试剂盒的说明书检测细胞的荧光素酶活性。

1.6 细胞转染

取对数生长期的细胞，以5×105个/孔接种于6孔板中。12 h后，按照Lipo3000试剂说明书，分别转染实验组、对照组及干扰组质粒。

1.7 CCK8实验

取对数生长期的细胞，按1×103个/孔接种至96孔板中，每孔加100 μl培养液，每组设5个复孔。在待测定孔中加入CCK8，2 h后用酶标仪检测实验组、对照组及干扰组吸光度值，连续测7 d，重复3次，绘制细胞增殖曲线。

1.8 干细胞成球实验

取对数生长期的细胞，PBS洗两次以去除血清。用5 ml干细胞培养基（成分：DMEM+B27+FGF+EGF）重悬细胞，按5×102个/孔铺到24孔超低吸附板中，补加干细胞培养基400 μl。12 d后观察干细胞球的状态及数目。成球率=每孔中直径＞75 μm的细胞球的个数/原始接种细胞数。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。CCK8增殖能力比较用Two-way ANOVA；相关性分析用Spearman相关检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织中miR-365a-3p的表达检测

miR-365a-3p在正常组织中的表达高于癌组织，差异有统计学意义（t=10.148，P=0.015），见图1A。miR-365a-3p在T1～T2期患者中的表达高于T3～T4期，差异有统计学意义（t=5.676，P=0.027），见图1B。

图1 miR-365a-3p在结直肠癌组织中的表达

2.2 miR-365a-3p与BMI1的结合情况

生物信息学网站预测出miR-365a-3p与BMI1的3’UTR区结合位点，见图2A，实验组双荧光素酶的数值明显下降，对照组双荧光素酶的数值无明显变化，实验组明显低于对照组，差异有统计学意义（t=10.112，P=0.013），见图2B。

图2 BMI1与miR-365a-3p的结合情况

2.3 BMI1的表达情况

Q-PCR结果显示实验组BMI1表达下降（t=6.378、5.784，P=0.004、0.005），干 扰 组BMI1表达升高（t=8.547、9.651，P=0.003、0.002），差异均有统计学意义。见图3。

图3 BMI1的表达情况

2.4 CD44、CD133及Lgr5的表达情况

与对照组相比，实验组CD44、CD133及Lgr5的表达下降（t=9.232、8.774、6.155，P=0.012、0.010、0.017），见图4A；而干扰组CD44、CD133及Lgr5的表达升高（t=5.271、6.157、5.125，P=0.032、0.029、0.033），见图4B，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。

图4 干细胞相关基因的表达

2.5 结直肠癌细胞增殖能力检测

CCK8实验表明，实验组细胞的增殖能力低于对照组，干扰组细胞的增殖能力高于对照组，第5天差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图5。

图5 CCK8检测细胞增殖能力

2.6 结直肠癌干细胞特性检测

干细胞成球实验表明，实验组干细胞成球数低于对照组（t=17.341、19.232，P=0.004、0.002），见图6A，而干扰组干细胞成球数高于对照组（t=8.212、5.473，P=0.017、0.041），见图6B，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。

图6 干细胞成球情况

3 讨论

miRNA是一类在真核细胞中广泛存在的非编码小RNA的总称，其主要通过诱导靶基因降解起到翻译抑制作用[8-12]。研究发现，一些miRNA可以通过靶向结合干细胞相关基因诱导肿瘤细胞凋亡，如miR-34a可通过结合CD44抑制乳腺癌干细胞的增殖[13]，miR-150可通过抑制肝癌细胞中C-myc、Bcl-2的表达而影响肝癌干细胞的特性[14-15]。

本研究发现miR-365a-3p在结直肠癌组织中表达降低，并且其表达与患者T分期相关，miR-365a-3p低表达的患者分期较差；生物信息学软件及荧光素酶报告系统实验证实，miR-365a-3p与BMI1的3’UTR区有结合位点，miR-365a-3p可抑制干细胞相关基因BMI1、CD44、CD133及Lgr5的表达，使结直肠癌干细胞的成球能力下降，并抑制癌细胞的增殖能力。但肿瘤的发生发展是极其错综复杂的过程，本研究还需要继续验证和探索。

综上所述，miR-365a-3p是一种抑制结直肠癌发生的重要microRNA，其通过调节BMI1的表达，影响结直肠癌干细胞特性，抑制结直肠癌细胞的增殖。本研究将为结直肠癌的预防、治疗和药物研制提供新思路和新靶标。