基于网络药理学的经典名方枸杞汤治疗糖尿病作用机制分析△

周洪立，郑慧丽，朱悦，尚尔鑫，宿树兰，段然，段金廒，许惠琴*

1.南京中医药大学 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210023；

2.宁夏枸杞创新中心，宁夏 银川 750000

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种慢性进行性疾病，发病率高且增长迅速，到2030 年全球DM 患病率预计将超过10.2%[1]。DM 的主要病理特点是胰岛素分泌缺陷或其他生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢紊乱[2]。患者血糖长期处于高水平状态，大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，引发多种并发症及随之而来的生活质量下降和死亡风险增加[3]。一系列横断面和前瞻性分析也表明，血糖浓度升高与并发症的发生呈正相关[4-7]。我国DM 患病人数位居世界首位，仅2015 年我国就有130 万人死于DM 及其并发症，给社会带来严重的健康与经济负担[7]。现阶段，DM 的主要治疗措施包括口服降糖药、注射胰岛素、饮食管理、锻炼等，这些措施在控制血糖方面表现出良好的效果，但无法从根本上治愈DM 及延缓其并发症的发生和发展。

中医将DM 归属于“消渴”范畴，传统观点认为，其主要病机以阴液亏虚为本、燥热偏胜为标、瘀血为患贯穿始终，针对该病机特点，以滋补肝肾、清热生津、化瘀通络为基本治法[2]。南朝齐陈延之[8]《小品方》中形成了消渴三消分治的雏形，并收载“枸杞汤”治疗“内消”，该方由枸杞枝叶、栝楼根、石膏、黄连、生甘草组成。《小品方》原书记载“消渴者，原其发动，此则肾虚所致”“夫内消之为病，皆热中所作也，小便多于所饮，令人虚极短气……治之枸杞汤”，是中医治疗消渴病的较早记载。该方以枸杞枝叶为君药，符合《神农本草经》枸杞“主热中消渴”[9]与《药性论》枸杞“子、叶同说，味甘，平。补益精，诸不足，易颜色，变白，明目，安神，令人长寿”[10]的功效认识，补益肝肾兼能清热；栝楼根（即天花粉）、石膏与黄连等药材清热生津，生甘草补气兼能清热，符合中医对消渴症“肝肾亏虚，阴虚内热”病机的认识。该方曾被唐代孙思邈收录于《备急千金要方》[11]，足见其对该方组方与疗效的认可。

基于血糖控制是临床改善DM 进程的根本方法及对枸杞叶“主治虚劳烦渴”传统功效的认识，本研究利用网络药理学的整体性与系统性，对枸杞汤改善DM 的作用机制进行初步探讨，分析其可行性，为临床DM治疗方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 枸杞汤有效成分的筛选与整理

通过中国知网（CNKI）、PubMed数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/），以“枸杞叶”“枸杞芽”“枸杞叶化合物”为关键词检索枸杞叶有效成分信息，利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://www.tcmsp-e.com/）[12]将所得化合物以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件筛选，获得枸杞叶有效成分；通过TCMSP 分别收集黄连、石膏、天花粉、甘草4 味中药的有效成分，同上述枸杞叶筛选条件获得有效化学成分，记录成分的编号和名称。通过TCMSP、PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和ChemDraw 18.0 软件获得有效成分的分子结构。

1.2 枸杞汤有效成分及DM疾病靶点的预测与收集

将筛选所得枸杞汤有效成分通过TCMSP、SwissTargetPrediction 平台（http://www.swisstarget prediction.ch/）[13]预测对应靶点。以“diabetes mellitus”为疾病关键词，通过OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank（https://www.drugbank.ca/）数据库检索，并与枸杞汤靶点取交集，获得枸杞汤改善DM 的潜在靶点信息。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将药物有效成分与疾病靶点取交集，并上传至STRING 11.5 数据库（https://string-db.org）构建交集靶点PPI 网络，生物种类设定为人类，将最小相互作用阈值设为0.9。利用Cytoscape 3.7.2 软件中的MCODE 和Network Analyzer插件进行聚类和拓扑分析，获得枸杞汤调节DM的核心靶点。

1.4 基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析

将筛选得到的枸杞汤调节DM 的靶点导入Metascape 3.5 平台，将生物种类设定为人类，设置P＜0.001，分别进行GO 富集分析和KEGG 通路分析，并将所得数据进行可视化分析。

1.5 药物-成分-靶点网络构建

将所得枸杞汤有效成分、治疗DM 相关靶点及通路富集分析结果进行映射，并导入Cytoscape3.7.2软件以构建药物-成分-靶点网络。

1.6 分子对接验证

PDB 数据库下载对接蛋白的PDB 结构，PubChem 数据库下载配体的SDF 结构，利用Open Babel 软件将SDF 配体小分子转换为PDB 格式。然后通过PubChem 数据库和Open Babel 3.1 软件得到化合物PDB 格式文件，利用AutoDock Vina 1.5.6软件进行分子对接，获取其结合自由能信息。

2 结果

2.1 枸杞汤有效成分的收集

通过TCMSP筛选和查阅文献[14-24]得到活性化合物数目分别为枸杞叶6 个、天花粉2 个、黄连6个、甘草80 个，石膏的主要成分CaSO4未检索到相关靶点，故不计入统计。去除重复后，枸杞汤共有活性成分94个，见表1。

表1 枸杞汤活性成分拓扑信息

续表1

续表1

2.2 潜在治疗靶点预测

通过TCMSP、SwissTargetPrediction 平台预测靶点，共获得枸杞汤靶点247 个。从GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 数据库检索疾病靶点，整合并删除重复值，经UniPort 数据库规范化后得到1832 个疾病靶点。利用Venn 作图取交集，如图1 所示，得到211个枸杞汤改善DM的潜在靶点。

图1 枸杞汤治疗DM的药物-疾病交集靶点

2.3 PPI网络分析

将从STRING 11.5 数据库获得的靶点PPI 图导入Cytoscape 3.7.2 软件，通过MCODE 聚类分析功能得到核心子网络，如图2～3 所示，靶点度值越大，形状越大，表明靶点与网络中其他靶点连接越紧密。热休克蛋白90α家族成员A（HSP90AA1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、MAPK3、表皮生长因子受体（EGFR）等排名靠前的靶点为枸杞汤改善DM的核心靶点。

图2 枸杞汤治疗DM核心靶点PPI

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

图3 枸杞汤治疗DM核心靶点PPI子网络

2.4.1GO 分析 利用Matescape 3.5 平台对枸杞汤改善DM的潜在靶点进行GO分析，枸杞汤主要通过参与循环系统过程、对细胞外刺激的反应、蛋白质磷酸化、分泌调节、细胞化学稳态、调节体液水平、小分子代谢过程的调节、腺体发育、离子传输的调节、对细胞因子的反应、调节细胞对压力的反应、老化等1996 个生物过程发挥改善DM 的作用；细胞组分条目共131 个，主要涉及膜筏、受体复合物、细胞质核周区、神经元细胞体、膜侧、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）复合物、黏着斑、转移酶复合物、转移含磷基团、细胞器外膜等；主要涉及蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、氧化还原酶活性、激酶结合、脂质结合、磷酸酶结合、激素结合、胰岛素受体底物结合、丝氨酸水解酶活性、氧化还原酶活性等228 个分子功能。将P＜0.001 排名前10 的条目进行数据可视化处理，见图4。

图4 枸杞汤治疗DM核心靶点GO分析

2.4.2KEGG 分析 利用Matescape 3.5平台对枸杞汤调节DM 的潜在靶点进行KEGG 分析，枸杞汤主要通过参与调节PI3K/蛋白激酶B（PI3K-Akt）、环磷酸腺苷（cAMP）、RAS 相关蛋白1（RAP1）信号通路、糖尿病并发症（diabetic complications）中的晚期糖基化终末产物（AGE）-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路、内分泌抵抗（endocrine resistance）、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、叉形头转录因子O（FoxO）信号通路、胰岛素（insulin）信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、2 型糖尿病（T2DM）等203 个通路发挥改善DM 的作用，将P＜0.001 排名前20 的条目运用R语言绘制气泡图，见图5。

图5 枸杞汤治疗DM核心靶点KEGG通路分析

2.5 药物-成分-靶点网络

通过CytoScape 3.7.2 软件构建药物-成分-靶点网络，如图6 所示，该网络共有155 个节点（包括4种药材、94 个活性成分、57 个靶点）。拓扑分析结果如表2所示，鳞叶甘草素A、3′-甲氧基光甘草定、甘草查耳酮B 等节点度值排名靠前，可能为枸杞汤中的主要活性成分。

图6 枸杞汤治疗DM药物-成分-靶点网络分析

2.6 分子对接结果

分析枸杞汤的药物-成分-靶点网络可知，鳞叶甘草素A、3′-甲氧基光甘草定、甘草查耳酮B 等成分的节点度值排名靠前，可能为枸杞汤的主要活性成分。选择核心化合物中的鳞叶甘草素A 与甘草查耳酮B对应核心靶点中的细胞色素P450家族19亚家族A 肽1（CYP19A1）、雌激素受体2（ESR2）、蛋白酪氨酸性磷酸酶非受体型1（PTPN1）、EGFR 进行分子对接，结合自由能结果见表2，可视化对接结果见图7。结果显示，枸杞汤中鳞叶甘草素A与甘草查耳酮B 均能与对应靶点自发结合，且鳞叶甘草素A 与CYP19A1、ESR2、PTPN1 之间的结合自由能较低，甘草查耳酮B 与EGFR 之间的结合自由能较低，表明鳞叶甘草素A 和甘草查耳酮B 与对应靶点之间有较好的结合活性，侧面验证了网络药理学的预测结果。

图7 枸杞汤治疗DM核心成分和靶点分子对接模式图

表2 枸杞汤核心成分与靶点蛋白分子对接结果

3 讨论

DM 的西医治疗以控制血糖及生活管理为主。血糖的控制包括口服降糖药及注射胰岛素，在降糖方面效果显著，但长期高血糖所伴随的并发症给疾病的治疗带来了诸多的挑战，如DM 临床一线治疗药物二甲双胍因其使用禁忌中明确包含了糖尿病肾病（DKD），给DKD 患者降糖药物的选择带来了困扰。在糖尿病视网膜病变（DR）等并发症的治疗中，在控制血糖的基础上多以对症治疗为主，以降低疾病进一步发展所带来的风险，对已发生的病理改变多采用对症治疗，如部分糖尿病性黄斑水肿（DME）患者经抗VEGF 疗法治疗后微血管瘤、渗出、静脉串珠、新生血管、出血等病变有所改善，但这并未解决其本质问题，即视网膜毛细血管周细胞凋亡、内皮细胞增殖和继发的毛细血管闭塞，以及缺血缺氧导致的VEGF 释放与进一步的眼底损伤。DM 的疾病机制探究和临床治疗方法开发是亟须解决的医学问题[25-26]。生活管理亦是DM 患者疾病控制的重要手段，当前对DM 患者的管理包括营养治疗原则，并参与规律、适量的体育锻炼。DM 患者的自我管理早在隋唐时期就有记载，巢元方提出“消渴”患者“先行一百二十步，多者千步，然后食之”，孙思邈提出“消渴”三慎:“一饮酒，二房事，三咸食及面”[27-28]。

近年来，随着中医药治疗DM 研究的不断深入，发现复方及单味中药在改善DM 及其并发症中疗效显著，而用药局限性及不良反应相对较小。中药具有多成分多靶点的优势，可干预疾病的不同靶点与信号通路，表现出多种药理学活性。枸杞汤作为中医经典方剂，为“治渴而利者方”，方中枸杞叶清热止渴、祛风明目、生津补肝，主治虚劳发热、烦渴、目赤昏痛、障翳夜盲等证，为君药；天花粉清热泻火、生津止渴，黄连泄火解毒，石膏清热泻火、除烦止渴共为臣药；甘草为使，调和诸药。诸药合用共奏滋阴清热、生津补虚之效。本课题组前期研究发现，枸杞叶中富含多糖、酚酸、黄酮等活性成分，包括芦丁、咖啡酸、绿原酸、新绿原酸、槲皮素-3-O-槐糖-7-O-鼠李糖苷等，且枸杞叶提取物可调节血糖和血脂水平，降低蛋白尿、转氨酶水平和减轻胰岛素抵抗，对糖尿病大鼠肾小球、肾小管和胰岛细胞起到保护作用[29-31]。亦有研究表明，枸杞叶提取物通过抑制高血糖介导的肾脏氧化应激和炎症改善糖尿病肾病，治疗后，糖尿病大鼠血清肌酐、尿素氮显著降低，白蛋白水平升高，而尿蛋白水平明显降低，肌酐清除率明显升高[32]。《名医别录》记载：“黄连止消渴。”其药效物质基础为黄连素，在DM及其并发症的治疗中应用已久[33-34]。黄连素能够增加葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达及活性，从而增加细胞对葡萄糖的摄取，起到降糖效应[35]，并可抑制高糖培养的肾小球系膜细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和纤维连接蛋白（FN）的表达，发挥抗DKD的重要作用[36]。研究发现，枸杞汤中的关键化合物光甘草定具有降糖作用，能显著提高小鼠体质量，糖耐量，肝、肾、胰组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低肝、肾、胰腺组织中纤维蛋白原（FBG）水平和丙二醛（MDA）含量[37]。而甘草查耳酮具有抗氧化活性，能增强细胞本身抗氧化能力[38]。

由成分-靶点-通路网络可知，枸杞汤中94 个活性成分主要通过HSP90AA1、SRC、STAT3、MAPK1、MAPK3、EGFR、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基1（PIK3R1）、PIK3CA、Akt1 等靶点，影响PI3K-Akt、cAMP、FoxO、AGE-RAGE、RAP1、HIF-1、VEGF、内分泌抵抗、胰岛素抵抗等信号通路，可能通过改善胰岛素抵抗、糖异生、葡萄糖转运、炎症及免疫反应来发挥改善DM 的作用。FoxO1 参与了β细胞的增殖、分化与凋亡、胰岛素抵抗及肝脏葡萄糖生成，且在脂质代谢和脂肪组织调节方面具有重要作用，未来可能成为糖脂代谢性疾病的治疗靶点[39]。VEGFA 是视网膜新生血管形成过程中的关键物质，DM 患者视网膜的长期缺血缺氧状态会引发VEGF 表达上调，并激活下游PI3K/Akt 信号通路，加速视网膜血管内皮细胞形成新生微血管腔这一过程[40]。HIF-1α是细胞内重要的缺氧信号蛋白，参与血管形成、糖代谢、红细胞生成及细胞的存活和凋亡等过程，而VEGF 主要受HIF-1α的转录调控，在高血糖和缺血缺氧状态下会诱导HIF-1α的表达上调，作为其下游重要的靶基因，VEGF 也随之上调[41-42]。AGEs 在糖尿病及其并发症中占有重要位置，陈玉萍等[43]认为，AGEs是糖尿病“肾阴亏虚、内热伤阴津”的重要物质基础。

“阴虚为本，燥热为标”为消渴病的基本病机，贯穿“消渴”的疾病始终。近年来，通过生物信息学、蛋白质组学、代谢组学、基因芯片等技术发现阴虚火旺证候主要涉及cAMP、花生四烯酸（arachidonic acid）、鞘脂（sphingolipid）等差异代谢产物，JAK/STAT、胰岛素、MAPK、腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）、色氨酸代谢（tryptophan metabolism）、酪氨酸代谢（tyrosine metabolism）等信号通路[44-47]。cAMP 作为信号分子参与活性氧（ROS）产生与应激反应，可促进下游cAMP 依赖性蛋白激酶（PKA）和环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）蛋白磷酸化，清除ROS，降低氧化应激水平，减轻2型糖尿病诱导的神经毒性[48]。而枸杞汤对上述部分信号通路及代谢产物具有干预作用，可能是其改善“阴虚火旺”证候的作用靶点。

本研究采用网络药理学方法构建了药物-成分-靶点-疾病网络，为枸杞汤治疗DM 作用机制的深入研究提供了参考，同时也为DM 的中医临床治疗提供了借鉴。