马齿苋多糖提取优化及抗氧化活性研究

王 博，陈美琼，郭翔宇，杨诗琪，曹权富，张俊杰，朱 梅

(北华大学理学院，吉林 吉林 132013)

马齿苋(PortulacaoleraceaL.)为马齿苋科一年生草本植物，又称长寿菜、长命菜，在我国分布广泛[1-2]，是国家卫健委划定的药食两用植物之一[3].马齿苋含有多糖、生物碱、多酚、黄酮等活性物质，具有提高免疫功能、抗感染、抗氧化等生物学活性[4].多糖是马齿苋的主要活性成分之一，具有抗氧化、增强免疫功能、保护神经、抗菌、抗病毒、抗糖尿病和抗肿瘤等多种生物学活性[2，5-6].抗氧化活性是马齿苋多糖的主要功能活性，李慧如[7]采用水提醇沉法提取的马齿苋多糖POP和杨电增等[8]采用双酶法提取的马齿苋多糖具有清除体外自由基的作用，牛广财等[9]发现马齿苋多糖能有效抑制衰老小鼠血清及肝、脑中的SOD活力的下降，还能显著降低衰老小鼠体内MDA的含量.近年来，植物多糖的抗氧化活性备受关注，许多植物多糖已成为天然抗氧化剂的来源.

1 材料与仪器

1.1 试验材料

供试材料马齿苋全草(PortulacaoleraceaL.，采自吉林省桦甸市，经北华大学理学院侯宇老师鉴定为马齿苋)；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster，北华大学理学院遗传实验室).

95%乙醇、无水乙醇、乙醚、甲醇、苯酚、Tris、浓硫酸(国产分析纯)；标准葡萄糖(北京索莱宝科技有限公司)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，上海麦克林生化科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所).

1.2 主要仪器

GalanzWD900B微波炉(顺德格兰仕电器厂有限公司)；DL-5-B 型离心机(上海嘉鹏科技有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；XS-10 500 g多功能粉碎机(上海兆申科技有限公司)；722S可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)；冷冻干燥机(上海皓庄仪器有限公司).

2 试验方法

2.1 马齿苋多糖的提取

将新鲜马齿苋洗净、干燥、粉碎、过筛，准确称取马齿苋粉末10 g，按一定液料比浸泡12 h，沸水提取2 h，微波处理，4 ℃条件下4倍体积95%乙醇沉淀12 h，4 000 r/min离心10 min，沉淀依次用无水乙醇、乙醚反复洗涤，50 ℃真空干燥箱烘干至质量恒定，sevage法脱蛋白[12]，得马齿苋粗多糖.

2.2 马齿苋多糖含量测定及提取率计算

标准曲线制作：采用苯酚-硫酸法[13]，以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标、以测定波长490 nm处的吸光度值为纵坐标绘制葡糖糖标准曲线[14]，得回归方程y=0.012 7x+0.003 4，R2=0.996 3.依据标准曲线检测样品吸光值，计算多糖含量及提取率：

多糖质量=多糖含量×多糖溶液体积，多糖提取率=多糖质量/原料质量×100%.

2.3 马齿苋多糖提取单因素试验

按照2.1的方法提取马齿苋多糖，固定反应条件为液料比V(mL)∶m(g)=30∶1、微波时间15 min、微波功率540 W，测定不同粉碎度(20、40、60、80、100目)对多糖提取率的影响；固定反应条件为粉碎度60目、微波时间15 min、微波功率540 W，测定不同液料比(V(mL)∶m(g)=10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)对多糖提取率的影响；固定反应条件为粉碎度60目、液料比V(mL)∶m(g)=30∶1、微波功率540 W，测定不同微波时间(5、10、15、20、25 min)对多糖提取率的影响；固定反应条件为粉碎度60目、液料比V(mL)∶m(g)=30∶1、微波时间15 min，测定不同微波功率(180、360、540、720、900 W)对多糖提取率的影响.

2.4 马齿苋多糖提取条件响应面试验设计

结合单因素试验结果，以提取率为响应值，粉碎度、液料比和微波时间为自变量，根据响应面Box-Behnken模型[15]，进行三因素三水平试验设计(见表1)，优化微波辅助水提醇沉马齿苋多糖提取工艺.

表1 响应面Box-Behnken试验因素与水平

2.5 马齿苋多糖体外抗氧化活性测定

2.5.1 DPPH·清除活性的测定

参照IMJONGJAIRAK S等[16]的方法，向1 mL浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL的多糖样液中加入1 mL浓度为 0.2 μmoL/L的DPPH甲醇溶液，混匀，阴凉避光处放置30 min，在517 nm波长处分别测定吸光值(A样品).同样方法，向以上各浓度1 mL多糖样液中加入1 mL无水乙醇，混匀后在517 nm波长处分别测定吸光值(A对照)；取1 mL DPPH和1 mL超纯水混匀，在517 nm波长处测定吸光值A空白.计算马齿苋多糖对DPPH·的清除率：DPPH·清除率=[1-(A样品-A对照)/A空白]×100%.

2.5.2 ·OH清除活性的测定

参照张晓艳等[1]和聂烁等[17]的方法，向1 mL浓度为1、2、3、4、5 mg/mL的多糖样液中加入1 mL 浓度为8 mmol/L的FeSO4溶液、水杨酸-50%乙醇溶液和H2O2，充分混匀后静置1 h，在510 nm波长处分别测定吸光值(A样品).同样方法，用超纯水替代多糖样液测定空白组吸光值(A空白)；用50%乙醇溶液替代水杨酸和50%乙醇的混合溶液测定对照组吸光值(A对照).计算马齿苋多糖对·OH的清除率：·OH清除率=[1-(A样品-A对照)/A空白]×100%.

2.6 马齿苋多糖在果蝇体内抗氧化活性测定

2.6.1 果蝇体内SOD活力的测定

参照文献[19]的方法(略有改动)，取250只刚羽化的雄果蝇随机分为5组，在相同体积培养基(多糖浓度分别为0、5、10、15、20 mg/mL)中培养7 d后，加生理盐水研磨成浓度为1∶20 mg/μL的果蝇匀浆，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，按照试剂盒说明测定SOD活力.

2.6.2 果蝇体内MDA含量的测定

试验步骤同2.6.1，按照试剂盒说明测定MDA含量.

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 粉碎度对马齿苋多糖提取率的影响

试验2.3结果显示：粉碎度为20目时，马齿苋多糖提取率最低，60目时马齿苋多糖提取率最高，为6.08%，80目时提取率呈下降趋势.这说明可能在一定范围内马齿苋多糖的溶解性随粉碎度的增加而增强，但超过一定范围会使多糖附着在样品颗粒表面，降低其溶解性[20].因此，选粉碎度为60目为最适条件.见图1.

图1 粉碎度对马齿苋多糖提取率的影响

3.1.2 液料比对马齿苋多糖提取率的影响

试验2.3结果显示：当液料比为V(mL)∶m(g)=30∶1 时，马齿苋多糖提取率最高，为6.22%；当液料比V(mL)∶m(g)=40∶1、50∶1时，马齿苋多糖提取率逐渐下降.这可能是由于液料比过低时多糖不能充分溶出，而液料比过高时多糖会溶解，不易沉淀析出[21].故最佳液料比选为V(mL)∶m(g)=30∶1.见图2.

图2 液料比对马齿苋多糖提取率的影响

3.1.3 微波时间对马齿苋多糖提取率的影响

试验2.3结果显示：当微波时间为10 min时，马齿苋多糖提取率最高，为6.13%，微波时间15、20、25 min时提取率逐渐下降.推测微波时间过长，增加了热量积累，引发多糖降解，从而导致提取率降低[22]，因此，微波时间在10 min时最为合适.见图3.

图3 微波时间对马齿苋多糖提取率的影响

3.1.4 微波功率对马齿苋多糖提取率的影响

试验2.3结果显示：当微波功率为180 W时，马齿苋多糖提取率最低，当微波功率为360、540 W时，提取率呈上升趋势，分别为6.05%和6.09%，当微波功率为720 W和900 W时提取率逐渐下降，推测微波功率高于一定范围时引起多糖部分降解，提取率下降.考虑到能量损耗，微波功率360 W为最佳提取功率.见图4.

图4 微波功率对马齿苋多糖提取率的影响

3.2 响应面优化试验结果

3.2.1 模型的建立及方差分析

在单因素试验结果基础上，以马齿苋多糖提取率为响应值(y)，粉碎度(A)、料液比(B)和微波时间(C)为主要因素，设计三因素三水平共17组试验，根据结果数据(见表2)利用Design-Expert 8.0软件进行回归拟合，得到回归方程：y=6.21+0.432 5A+0.121 3B+0.381 3C-0.120 0AB-0.395 0AC+0.397 5BC-0.754 8A2-0.642 3B2-0.452 2C2.见表2.

表2 响应面优化试验设计及结果

表3 回归模型的方差分析

3.2.2 响应面各因素交互作用分析

由图5可见，AC 和BC 交互作用的等高线图为椭圆形，响应面图坡度较陡，交互作用显著；AB交互作用的等高线图接近圆形，响应面图坡度较缓，交互作用不显著.由图5 a可见，粉碎度响应曲面坡度较陡，说明粉碎度对马齿苋多糖提取率的影响高于液料比；由图5 b可见，粉碎度与微波时间响应曲面坡度相似，说明粉碎度和微波时间对马齿苋多糖提取率的影响相似；由图5 c可见，微波时间响应曲面坡度较陡，说明微波时间对马齿苋多糖提取率的影响高于液料比.应用Design-Expert 8.0 分析结果显示：马齿苋多糖最优提取工艺条件为粉碎度62.98目、液料比V(mL)∶m(g)=32.21∶1、微波时间12.27 min，在此条件下提取率为6.34%.为验证响应面模型是否可靠，结合实际情况最终确定优化条件为粉碎度60目、液料比V(mL)∶m(g)=32∶1，微波时间12 min，试验3次，得马齿苋多糖(POPC)提取率的平均值为6.31%，该值与预测结果相近，说明经过响应面优化后微波辅助水提醇沉马齿苋多糖的提取工艺条件合理可行.

图5 各因素交互作用对提取率的响应面和等高线

3.3 马齿苋多糖体外抗氧化活性

DPPH·在乙醇溶液中呈深紫红色，被还原剂还原后颜色变淡甚至消失，可作为评价POPC抗氧化活性的依据.试验2.5.1结果见图6.POPC对DPPH·的清除率虽然明显弱于阳性对照组Vc，但随POPC浓度升高对DPPH·的清除率呈持续增强趋势，且浓度为5 mg/mL时清除率最高，为(38.85±2.31)%，经计算IC50值为6.79 mg/mL.可见，POPC具有一定清除DPPH·的能力.

图6 POPC对DPPH·的清除率

·OH 氧化能力极强，可与水杨酸反应生成紫色物质，加入抗氧化剂后，溶液颜色变浅甚至消失[23].试验2.5.2结果见图7.POPC对·OH的清除率弱于阳性对照组Vc，但对·OH的清除率在试验浓度范围内有剂量依赖性，浓度为5 mg/mL时清除率最高，为(43.87±2.09)%，结果表明：POPC具有良好清除·OH的能力，经计算得其清除·OH活性的IC50值为6.59 mg/mL.

图7 POPC对·OH的清除率

图8 POPC对的清除率

3.4 马齿苋多糖果蝇体内抗氧化活性测定

试验2.6结果(见图9～10)显示：POPC各剂量组较空白对照组均能提高果蝇体内 SOD 活力，且随剂量增加呈先上升后下降趋势，POPC浓度为10 mg/mL时，果蝇体内SOD活力最高，SOD活力比空白对照组提高了(191.97±2.25)%.POPC浓度为15、20 mg/mL时，果蝇体内SOD活力呈下降趋势，推测高浓度POPC反而抑制SOD活力；POPC各剂量组的果蝇体内MDA含量均低于空白对照组，呈随剂量增加先降低后升高的趋势，浓度为15 mg/mL时果蝇体内MDA含量最低，比空白对照组降低了 (66.40±1.91)%.

图9 POPC对SOD活力的影响

图10 POPC对MDA含量的影响

4 结 论

综上，本试验结果可为马齿苋多糖提取条件的优化研究及其作为抗氧化药品、功能性食品的开发利用提供试验依据，为进一步深入研究马齿苋多糖的结构、生物学活性及构效关系提供一定的实验基础.