胎儿游离DNA高通量测序在产前诊断中的应用价值

韩咏梅

淄博市妇幼保健院，山东淄博 255000

出生缺陷是指婴儿出生前发生的身体结构、功能或代谢异常，可由染色体畸变、基因突变等遗传因素或环境因素引起，也可由这两种因素相互作用或其他不明原因所致。调查发现，我国是出生缺陷高发性国家，总发病率为5.6%，年均新增90万例，而染色体异常占比0.5%～0.8%，也是引起出生缺陷的高危因素。目前，超声检查、早中孕期血清学筛查是产前筛查的首选方式，但后者呈现检出率低（70.00%）、假阳性率高（5.00%）等缺陷，极易面临漏诊、误诊，增加不必要的介入产前诊断等行为。介入性产前诊断会增加自身负担，面临胎儿丢失（羊膜腔穿刺占比0.11%、脐静脉穿刺占比0.35%）、宫内感染和胎膜早破等状况，造成产妇及家庭等层面负担。探寻更为准确、安全的产前筛查方式，尽早评估胎儿染色体是否异常，是增强产前诊断效率、质量的关键[1]。选取2020 年1 月—2021 年6 月淄博市妇幼保健院施行无创DNA 检测孕妇共21 705 例为研究对象，明确胎儿游离DNA 高通量测序的价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院施行无创DNA 检测孕妇共21 705 例为研究对象，平均年龄（31.62±5.03）岁、平均孕周（18.73±3.15）周。

1.2 方法

①采血。抽取10 mL 外周血置入Cell-Free DNA BCT 采血管（血浆游离DNA 采血管）内，上下颠倒8～10 次，保证其均匀混合，再张贴条码做好标记；置于4～8℃环境下保存，48 h 内送往遗传专科实验室[2-3]。

②提取胎儿游离DNA。4℃环境下，将血样经16 00 g离心处理，10 min后取上层清液再次16 000 g离心处理10 min，以此清除白细胞及碎片，获取上层血浆。依据磁珠法，提取游离DNA，再联合定量分析仪的运用鉴别其浓度[4-5]。

③建立DNA 测序库。借助可逆末端终止测序法，建立相应的DNA 测序库，以cffDNA 为准对其末端予以补平，再和测序通用引物连接；随后构建文库施行产物纯化处理，联合Stepone plus QPCR 仪予以定量测定[6-7]。

④数据测序和分析。借运用高通量基因测序仪，依据各流程标准施行测定，再将各数据传递至生物信息软件，通过和基因组序列间的比较，获取Z值（表明各染色体占比评分情况）。若Z值在-3.0～3.0为正常，＞3.0 表明为染色体三体，＜-3.0 表明为染色体单体高危[8-9]。

⑤介入性产前检查、染色体核型。若胎儿cffDNA 检测为高风险，应在其知情同意下施行介入性产前检查。是以B 超引导为前提，妊娠18～23+6周时采取羊膜腔穿刺，≥24 周时采用经皮脐血穿刺，随后施行细胞培养、染色等处理，获取其核型[10]。

1.3 观察指标

分析检测结果、检测筛查效率及妊娠结局。

灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100.00%；特异度=真阴性/（真阴性+假阳性）×100.00%；假阳性率=假阳性/（假阳性+真阳性）×100.00%；阳性预测值=真阳性（真阳性+假阳性）×100.00%；阴性预测值=真阴性/（真阴性+假阴性）×100.00%[11]。

1.4 统计方法

采用SPSS 24.0 统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料用（±s）表示；计数资料用[n(%)]表示。

2 结果

2.1 检测结果

21 705 例无创DNA 筛查中，检出异常者279例，占比1.29%。包括61 例为T21 三体高风险、18 例为T18 三体高风险、23 例为T13 三体高风险、126 例性染色体非整数倍异常、49 例为其他常染色体异常、2例为多条染色体异常。见表1。

表1 外周血cffDNA检测结果及染色体核型

针对T21、T18、T13 三体高风险孕妇，取羊水穿刺法，施行染色体核型分析、FISH 联合检测；性染色体非整数倍异常、其他常染色体异常孕妇，取羊水穿刺法，施行染色体核型分析、基因芯片联合检测。

①T21 三体高风险者，羊水穿刺共55 例，包括：47,Xn,+21 核型34 例，46,Xn,r(21)(p13;q22.3)[88]/45,Xn,-21[12]核 型1 例，47,Xn,der(21)t(2;21)(p22.2;q21.3)+21 核型1 例，46,Xn 核型19 例。未羊水穿刺共6 例，包括1 例脑积水引产、1 例宫内胎儿死亡引产，但均未采取后续研究。

②T18 三体高风险者，羊水穿刺共14 例，包括：47,Xn,+18 核型12 例，46,Xn 核型2 例。未羊水穿刺共4 例，包括1 例胎儿心脏异常引产，但未采取后续研究。

③T13 三体高风险者，羊水穿刺共17 例，包括：47,Xn,+13 核型1 例，核型正常16 例。余下6 例未采取产前诊断，但1 例应多发畸形引产、1 例因唇腭裂引产。

④性染色体非整数倍异常（SCA）者，羊水穿刺共98例，包括：47,XYY核型8例，47,XXY核型15例，47,XXX 核型4 例，45,X 核型1 例，45,X/46,XX 嵌合核型3例，45,X/46,XY嵌合核型1例，45,X/47,XXX嵌合核型1 例，47,XXY/46,XY 嵌合核型1 例，46,X,?del(X)(p11.3p22.1)核型1 例。核型正常63 例，但基因芯片检查中，检出2 例致病性拷贝数变异，4 例临床意义不明拷贝数变异。未采取产前诊断28 例，但1 例因唇腭裂引产、1例因胎膜早破引产。

⑤其他常染色体异常者，羊水穿刺共36 例，包括：46,XX,del(18)(p10)[52]/46,Xn,i(18)(q10)[8]核型1例，核型正常35 例，但基因芯片检查中，检出5 例致病性、可疑致病性拷贝数变异，7 例临床意义不明拷贝数变异，8号染色体单亲二倍体1例。未羊水穿刺共13 例，包括1 例宫内死亡引产、1 例心脏异常引产。

⑥多条染色体异常者中，羊水穿刺共1 次，核型、基因芯片检查均未存在异常；1 例孕妇确诊为淋巴浆细胞淋巴瘤后引产，但未采取后续研究。

2.2 检测筛查效率

①T21 三体高风险，灵敏度为100.00%（36/36）、特异度为99.91（21 650/21 669）、假阳性率为0.09%（19/21 669）、阳性预测值为59.01%（36/61）、阴性预测值为100.00%（21 650/21 650）。②T18 三体高风险，灵敏度为100.00%（12/12）、特异度为99.99%（21 691/21 693）、假阳性率为0.01%（2/21 693）、阳性预测值为66.67%（12/18）、阴性预测值为100.00%（21 691/21 691）。③T13三体高风险，灵敏度为100.00%（1/1）、特异度为99.93%（21 688/21 704）、假阳性率为0.07%（16/21 704）、阳性预测值为4.35%（1/23）、阴性预测值为100.00%（21 688/21 688）。④SCA，灵敏度为100.00%（35/35）、特异度为99.71%（21 607/21 670）、假阳性率为0.29%（63/21 670）、阳性预测值为27.78%（35/126）、阴性预测值为100.00%（21 607/21 607）。⑤其他常染色体异常，灵敏度为100.00%（1/1）、特异度为99.84%（21 669/21 704）、假阳性率为0.16%（35/21 704）、阳性预测值为2.04%（1/49）、阴性预测值为100.00%（21 669/21 669）。⑥多条染色体异常，特异度为100.00%（21 704/21 705）、假阳性率为0.00%（0/2）、阳性预测值为0.00%（0/2）、阴性预测值为100.00%（21 704/21 704）。

2.3 妊娠结局

①外周血cffDNA 检测异常者中，共随访276例，失访3 例，随访率为98.92%。染色体异常者共83例，77 例已引产，余下6 例出生后表型未异常；核型正常者共144 例，因基因芯片异常引产9 例，电话随访135 例出生后无异常，58 例未施行介入性产前诊断，但6 例因彩超异常引产，2 例因胎死宫内引产，1 例因胎膜早破引产，1 例因孕妇患淋巴浆细胞淋巴瘤引产，余下45 例出生未见表型异常，失访3 例。

②检测结果未异常者21 426 例，电话随访妊娠结局共20 296 例，随访率为94.73%，其中1 425 例仍未分娩。包括流产21 例（0.11%）、胎儿发育停止28例（0.15%）、先天畸形47 例（0.25%）、出生后夭折18例（0.10%）。

3 讨论

染色体异常作为胎儿出生缺陷的首要原因，由此产生的病症均可称为染色体病，常表现为多发畸形、生长发育迟缓及性发育障碍、重症智力低下等，但目前仍没有最佳治疗方案，所以该类患儿出生往往会增加家庭、社会等层面负担[12]。在此期间，产前筛查和诊断等工作的施行，可尽早发现疾病，通过针对性干预，降低染色体病患儿出生。例如：孕妇外周血cffDNA 检测技术，以自身安全可靠、准确性高等特点成为产前筛查的首选，更是为遗传咨询提供助力，保证人口素质健康[13-14]。

诸多研究证实，肿瘤患者血浆内富含肿瘤细胞DNA，由此受到启发。首次PCR 技术下测定孕妇外周血Y 染色体DNA 片段，从中获取cffDNA，为产前筛查迈向新台阶。调查发现，妊娠4 周时母体血浆可检出cffDNA，妊娠8周以上时浓度呈稳定状态，并随孕周的延长而增加，妊娠12 周后93.5%胎儿游离DNA 含量达4%，可满足高通量测序的检测要求；分娩后胎儿游离DNA 快速下降，产后72 h 消失，即以孕妇外周血浆cffDNA 为前提的产前筛查，不会受到既往妊娠的影响，还可为疾病筛查提供可靠依据[15-16]。

目前，产前筛查是以T21、T18 及T13 常见染色体非整倍体异常为目标染色体，且和血清学检查相比呈现检出率高、假阳性率低等优势，是目前产前筛查的辅助项目。该研究可知，T21/T18/T13 复合灵敏度为100.00%，特异度分别为99.91%、99.99%、99.96%。和Zhou Q 等[17]学者研究结果相似，其研究结果T21、T18、T13 灵敏度均为100.00%，特异度分别为99.94%、99.90%、99.96%。

WHO 数据调查显示，人类染色体异常中SCA 占据50%以上，且每400个表型正常群体中就会存在1例某种形式SCA，如47，XYY、47，XXX 及相关嵌合体，虽不表现为表型异常，但绝大部分胎儿会存在性功能发育障碍，少部分会表现为智力发育迟缓和性格改变。即使在胎儿正常出生后，经家属自述为表型正常，但也不能忽略有染色体异常倾向。另外，外周血cfffDNA 产前筛查存在个别假阳性、假阴性事件，可能和限制性胎盘嵌合体、母体超重、母体染色体异常、母体患有恶性肿瘤等因素存在相关性[18]。该研究中有1 例高通量测序示胎儿多条染色体异常，孕妇确诊为恶性肿瘤（淋巴浆细胞淋巴瘤），考虑为孕妇游离凋亡细胞的肿瘤DNA 释放到血液循环中，被误认为是胎儿的非整倍体。

综上所述，孕妇外周血cffDNA 检测是产前辅助筛查技术，呈现灵敏度和特异度高、假阳性率低等优势，可弥补血清学筛查、B 超检查等缺陷，其筛查结果更为精确，可避免漏诊事件，还可减少不必要的介入性产前诊断，减轻胎儿死亡带来的心理压力，强化出生缺陷二级预防工作。