COL1A1基因在3个猪群体内的多态性分析

吴华莉，张莺莺，黄 济，涂尾龙，王洪洋，曹建国，谈永松

（1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 闵行 201106；2.上海种猪工程技术研究中心，上海 浦东新区 201302）

COL1A1基因（Ⅰ型胶原α1亚基基因）是人类骨质疏松病的重要候选基因[1]。它编码Ⅰ型胶原蛋白的α1链，Ⅰ型胶原蛋白在骨骼和结缔组织中含量丰富[2]。人COL1A1基因定位于17q21.33，由51个外显子构成[3]。人COL1A1基因多态性被证实与绝经后妇女患骨质疏松风险有关[4]。据报道，COL1A1基因突变与成骨不全症、骨关节炎和软组织损伤有关[5-7]。COL1A1基因的突变可能会影响胶原蛋白的生物合成途径，影响细胞外基质-受体的相互作用，因此，COL1A1可能在成骨不全症的发病机制中发挥重要作用[3]。COL1A1基因多态性对骨原性肉瘤患者的生存率有预后价值[8]。猪COL1A1基因序列存在突变位点，其产生的AA基因型的屠宰率与AG基因型的屠宰率差异显著（P＜0.05）[9]。本研究通过检测猪COL1A1基因突变位点在杜洛克猪、长白猪和大白猪群体内的基因型和等位基因频率，以及在3个猪群体内群体遗传学指标，期望为寻找猪生长发育和疾病方面的分子遗传标记提供基础数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验样品

试验于2021年12月至2022年2月在上海市农业科学院畜牧兽医研究所进行。采集样品包括92头杜洛克猪、77头长白猪和152头大白猪的耳组织块，总计321头，来源于上海祥欣畜禽有限公司。PCR试验所用试剂和内切酶AluⅠ购于宝生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取采用AXYGEN基因组试剂盒提取猪耳组织DNA，测定DNA浓度，统一稀释样品浓度为50.0 ng/mL，-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增引物及反应条件。上游引物：5'-GCAACCTGGACGCCATCAAA-3'；下游引物：5'- TCTGGGAAGCCTCAGTGGACAT-3'[9]。PCR反应体系按照如下步骤配置： 2×Taq PCR Master Mix 27.5 μL，DNA 模板 1.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNase-Free ddH2O 20.5 μL，总体积为50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，64 ℃30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 20 min。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测试验结果。

1.2.3 基因型分析猪COL1A1基因PCR扩增片段长度为529 bp，存在AluⅠ酶切位点。采用具有单一目的条带PCR产物，进行限制性内切酶试验，采用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。限制性内切酶消化试验的反应体系：PCR产物5 μL，10×Buffer 2 μL，AluⅠ0.5 μL， ddH2O 8.5 μL，总体积为16 μL。反应时间为1 h。猪COL1A1基因PCR扩增产物经过内切酶消化后产生的不同基因型判定标准见表1。

表1 猪COL1A1基因酶切后的3种基因型

1.3 数据统计及分析

计算COL1A1基因在3个猪群体内的基因型频率、等位基因频率以及合并基因型频率，计算方法参见参考文献[10]。采用GENEPOP 3.1软件计算基因杂合度（Heterozygosity, He）、纯合度（Homozygosity, Ho）、有效等位基因数（effective number of alleles, Ne）和多态信息含量（polymorphism information content, PIC）。

2 结果与分析

2.1 PCR-RFLP检测

采用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。如图1所示AA型为1条带，GG型为2条带，AG型杂合子为3条带。根据电泳检测结果统计所有样品的基因型。

图1 猪COL1A1基因酶切结果检测电泳

2.2 猪COL1A1基因在3个猪群体内的基因型频率、等位基因频率和群体遗传学指标

采用PCR-RFLP技术，COL1A1基因在3个猪群体内的多态性检测结果见表2。COL1A1基因的基因型频率和等位基因频率表现为：在杜洛克猪群体内检测出AA型为主要基因型，杂合子AG基因型略少，只有少量GG基因型，A等位基因为优势等位基因；在长白猪和大白猪群体内检测AG基因型为优势基因型，GG基因型略少，AA基因型较少，G等位基因为优势等位基因。群体遗传学指标分析结果显示，COL1A1基因在杜洛克猪、大白猪和长白猪群体内PIC值在0.25～0.5之间，表现为中度多态。

表2 COL1A1基因在3个猪群体内的基因型频率、等位基因频率和群体遗传学指标

3 讨论

胶原蛋白是骨基质中最丰富的蛋白质，约占骨组织总蛋白质的80%。骨基质中胶原性质及其相对数量的改变会影响骨组织的力学特性，增加脆性骨折的易感性。胶原蛋白由α1和α2两条肽链组成，它们以2∶1的比例存在于胶原纤维中，分别由COL1A1和COL1A2（Collagen type Ⅰalpha 2）基因编码[6]。有研究证实在COL1A1 基因中已经发现多个突变与人类疾病相关，其中大多数与骨质疏松症相关[11]。COL1A1不仅是预测严重骨相关疾病的主要候选基因，而且在一般人群中也是天然骨变异的主要候选基因[12]。本试验的研究结果显示COL1A1基因在杜洛克猪、长白猪和大白猪群体内呈现3种基因型。在杜洛克猪群体内AA基因型为优势基因型，在长白猪和大白猪群体内AG基因型为优势基因型，COL1A1基因在杜洛克猪、长白猪和大白猪群体内PIC值在0.25～0.5之间，表现为中度多态。A等位基因频率在杜洛克猪群体内为优势等位基因，G等位基因在长白猪和大白猪群体内为优势等位基因。这与杨金娥的研究结果一致[9]。猪在养殖过程也患有骨骼疾病，如佝偻病、软骨病和骨质疏松及后肢瘫痪等[13]。尽管加强饲料营养可以改善症状，但关于猪骨骼疾病与基因突变位点是否存在相关性仍需要研究。接下来可以深度挖掘猪COL1A1基因更多的突变位点，结合猪机体的生长发育指标和疾病情况，尤其是猪的骨骼代谢指标，进一步分析这些突变位点与性状之间的相关性，从而寻求与猪骨骼疾病相关的候选基因。